Пример мультилендинг: Мультилендинг: примеры, способы создания

Что такое мультилендинг | Медиа Нетологии

Разобраться

6 февраля 2018

6 февраля

Дарья Офицерова, редактор блога Платформы LP, рассказывает, что такое мультилендинг и как это работает.

Эффективность лендингов в одном конкретном предложении: оффер в заголовке ведет посетителя по странице к целевому действию — покупке товара или регистрации на мероприятие. Но есть функция, которая позволяет не только сфокусироваться на одном предложении, но адресовать его определенной группе посетителей. Это мультилендинг, одна из самых эффективных функций, с помощью которой можно увеличить конверсию одностраничного сайта до 40%.

Программа обучения: «Интернет-маркетолог: от новичка до профи»

Что такое мультилендинг?

Мультилендинг — это несколько вариантов одной страницы: с разным текстом заголовка на первом экране или с разным дизайном.

Пример

Представим, вы продаёте фитнес-браслет с помощью лендинга.

У вас три клиента: Петр, Антон и Денис.

• Первый открывает вашу страницу и видит: «Здравствуй, Петр! Этот фитнес-браслет для тебя».
• Второй читает: «Привет, Антон! Для тебя этот фитнес-браслет».
• Третий: «Фитнес-браслет для тебя, Денис!».

Все они видят одну страницу, но разные заголовки и свое имя в нем. Каждый покупает фитнес-браслет — персональный подход располагает.

Мультилендинг работает по такому же принципу. Только вы обращаетесь не к одному человеку, а к определенной группе.

Когда мультилендинг полезен?

Допустим, вы разбили аудиторию на группы, но как понять — посетитель из какой группы зашел на страницу? Для этого есть UTM-метки. UTM-метки — это дополнительная информация к ссылке на сайт.

Пример

Ссылка №1: https://platformalp.ru/

Ссылка №2: https://platformalp.ru/?utm_source=yandex_direct&utm_medium=cpc&utm_campaign=january

Обе ссылки ведут на одну страницу, но вторая несет дополнительную информацию – откуда пришел посетитель.

Есть несколько видов UTM-меток:

• utm_source — источник перехода, например, yandex или google;
• utm_medium — формат размещения (тип трафика), например, cpc или banner;
• utm_campaign — название проводимой рекламной кампании;
• utm_content — содержание, тема кампании и другая дополнительная информация;
• utm_term — ключевые слова.

Для настройки мультилендинга понадобится метка utm_term.

Когда вы сделали страницу и запускаете трафик, например, контекстную рекламу в Яндекс.Директ, прописываете в ссылке utm_term для ключевых слов и используете их в мультилендинге. Так вы сможете показывать определенную версию страницы группе посетителей, которые пришли по одним ключевых словам.

Мультилендинг будет полезен, если:

a) вашу аудиторию легко разбить на небольшие группы по ключевым словам;

б) вы размещаете платную рекламу в поиске или в социальных сетях, а значит используете UTM-метки.

Ок, мультилендинг!

Итак, вы делаете лендинг, планируете размещать рекламу и представляете, как разбить аудиторию на группы. Тогда вот краткий план, как запустить мультилендинг.

1. Создаем базовую страницу — лендинг, который будет показываться посетителям, которые не попадают ни в одну категорию. На основе нее вы будете в дальнейшем создавать страницы для разных групп.
2. Запускаем рекламу. Инструмент, который лучше сработает, выбирать вам: Яндекс.Директ, Google Adwords, реклама ВКонтакте, Facebook или что-то ещё — главное, не забудьте прописать utm_term.
3. Когда лендинг готов и UTM прописаны, создаем варианты страницы под выбранные ключевые слова. В Платформе LP, например, это легко можно сделать внутри редактора.
4. Публикуете страницу и теперь, когда посетитель приходит из рекламного объявления по выбранному ключевому слову, ему показывается соответствующая страница.

Пример

ООО «СуперБетон» продает бетон в ЦФО, пишет на сайте: «Бетон в ЦФО по низким ценам» и запускает соответствующую рекламу. Но строитель не хочет думать, в каком федеральном округе он живет, он хочет купить бетон в Воронеже.

Тогда прописываем utm_term для разных городов:

Для Воронежа:

http:// superpuperbeton. ru/?utm_source=yandex_direct&utm_medium=cpc

&utm_campaign=beton_voronezh&utm_term=kupit_beton_voronezh 

Для Липецка:

http:// superpuperbeton. ru/?utm_source=yandex_direct&utm_medium=cpc

&utm_campaign=beton_lipetzk&utm_term=kupit_beton_lipetzk 

Теперь, заходя по рекламной ссылке в Яндексе, строитель из Воронежа увидит: «Бетон в Воронеже от 2300р/куб».

Результаты

Мультилендинг позволяет посетителю видеть то, что он ожидает увидеть — решение его конкретной проблемы и персональное обращение к нему как к представителю аудитории. Это может быть не только аудитория по городам, но аудитория по запросам на конкретную модель продукта, которую вы продаете, или профессиональная группа.

Пример

Для продвижения курса по верификации лжи специалисты из агентства FAQ маркетинг, создали три версии лендинга: для сотрудников полиции, кадровиков и риелторов.

1. Рекламный текст и лендинг для сотрудников полиции:

2. Лендинг для сотрудников HR-отдела:

3. Рекламный текст и лендинг для риелторов:

Читать ещё: «Правильная структура лендинга: советы»

Так, потратив на настройку мультилендинга несколько минут, можно повысить эффективность посадочных страниц в разы.

Мнение автора и редакции может не совпадать. Хотите написать колонку для «Нетологии»? Читайте наши условия публикации.

Оцените статью

Средняя оценка 5 / 5. Всего проголосовало 1

Темы: маркетинг редактура и копирайтинг

Мультилендинг | База ответов Платформы LP

Настраиваем динамическую посадочную страницу, мульти лендинг

Содержание:
1. Что такое мультилендинг?
2.Как настроить мультилендинг?
3.Как настроить мультилендинг для посетителей с определенного города?
 

1.Что такое мультилендинг?

Мультилендинг – это динамическая посадочная страница.
В отличие от простого лендинга, мультилендинг содержит адаптивный контент, который меняется в зависимости от запросов потенциального клиента.

Пример
Если клиент перешёл на страницу по объявлению с ключевым словом «дёшево», то на первом экране он увидит заголовок «Создавайте лендинги, тестируйте и повышайте их конверсию без лишних затрат».
Во всех остальных случаях клиент увидит заголовок: «Создавайте лендинги, тестируйте и повышайте их конверсию без технических навыков».

Важно! Мультилендинг не работает при переходе через поиск из поисковой системы. Для корректного отображения нужного контента, необходимо использовать ссылки с уже установленными значениями и метками. Эти ссылки помещаются в рекламные объявления, переходя по которым пользователь видит нужное содержание страниц.

2.Как настроить мультилендинг?

Для настройки мультилендинга нужно зайти в редактор страницы, в верхнем меню нажать кнопку «Страница», далее перейти в закладку «Мультилендинг».

Настройки для отображения страниц будут отражены в url’e (эта функция отдельно настраивается в рекламной кампании на Яндекс или Google).

В данном случае, как пример, мы используем параметр utm_term – он отвечает за ключевые слова.

Чтобы контент на странице менялся для ключевого слова «Дёшево» нужно:

• Выбрать условие «Содержит»,

• Нажать вкладку «Добавить вариант»,

• В появившемся поле написать: «Дёшево».

Далее нужно нажать галочку для сохранения.

В нужных секциях необходимо создать свой вариант мультилендинга секций.

В качестве примера рассмотрим 2 варианта:
 1 вариант: «Дёшево»;
 2 вариант : «Очень дёшево».

Название вариантам можно задать любое. Когда значок мультилендинга на секции стал зеленый, значит функция мультилендинга включена и секция стала динамической.

Базовый вариант – это вариант секции по умолчанию, который будет показываться по прямой ссылке.
Например, http://вашастраница.ru

Далее переходим во вкладку «Условия Мультилендинга». Здесь можно настроить вариант и условие.

При условии, что параметр «utm_term» содержит слово «Дешево», можно выбрать показ варианта «дешево». Этот вариант будет доступен на опубликованной странице по ссылке:
http://вашастраница.ru/?utm_term=Дешево

где вашастраница.ru – это адрес вашего сайта,
 /?utm_term – метка,
 дешево – ключевое слово.

Если вы используете больше одного ключевого слова в варианте, то в ссылке можно указать их через пробел, “–” или “_”.

Пример:
 Если в одном варианте мультилендинга нужно указать два слова, то их можно добавить, например, так: «очень дешево», в ссылке это будет выглядеть следующим образом: «очень%20дешево» (если в ссылке есть пробел, он автоматически заменяется на значение %20) или можно указывать с нижним подчеркиванием между слов: «очень_дешево».
С пробелом:
http://вашастраница.ru/?utm_term=очень%20дешево
С подчеркиванием:
http://вашастраница.ru/?utm_term=очень_дешево

Важно! При использовании знака “+” мультилендинг корректно работать не будет. Замените его пробелом, “–” или “_”.

Если Вы хотите открыть страницу на определенной секции, то необходимо использовать ссылку: http://вашастраница.ru/?utm_term=Дешево#blok1.
#blok1 в конце ссылки – ID секции, до которой нужно спуститься сразу при переходе по ссылке. Указать якорь необходимо в настройках секции – «Параметры» – Якорь.

Важно: ID секции указывается без решетки. Решетка перед ID добавляется только в ссылке. Например, если хотите установить в ссылку якорь #blok1 (как в примере выше), ID секции должен выглядеть так:

Условия мультилендинга возможно настроить только для одной метки. Вы можете отследить несколько меток с помощью соединения &. Все они отобразятся в статистике. Но, условия мультилендинга настроить только на одну из них.

Пример ссылки, в которой несколько меток для статистики:
http://вашастраница.ru/?utm_source=direct&utm_medium=cpc&utm_campaign=phone&utm_content=discount&utm_term=buy_phone
Но, мультилендинг настраивается только на одну из этих меток. Например, на последнюю utm_term=buy_phone

3.Как настроить мультилендинг для посетителей с определенного города?

Например, нам нужно, чтобы посетители с Москвы и Краснодара видели разный контент на странице. Как это сделать?

Шаг 1.
Создайте несколько рекламных объявлений (под каждый нужный город). К каждому из них присвойте уникальную utm метку. Например:
mysite.ru/?utm_term=Krasnodar и mysite.ru/?utm_term=Moscow

Шаг 2.Настройте ограничение показа, чтобы это объявление рекламировалось только в пределах Краснодара или Москвы. Таким способом вы можете настроить мультилендинг на определенную UTM метку, соответственно — на переход с рекламного объявления в определенном городе.

Более подробно о работе UTM меток для аналитики, можно узнать в нашей инструкции:
Создание и использование UTM меток

Мультилендинг: что это и как создать

Мультилендинг — инструмент, который позволяет увеличить конверсию сайта за счет персонализации предложений. Рассказываем, как сделать мультилендинг с нуля и из готовой страницы, кому это будет полезно и на что следует обратить внимание. Делимся советами по повышению эффективности.

• Что такое мультилендинг и когда он нужен
• Преимущества мультилендинга
• Кому полезен мультилендинг
• org/ListItem»> Примеры мультилендинга
• Как подготовиться к созданию мультилендинга
• Как сделать мультилендинг с нуля
• Как сделать мультилендинг из готовой страницы
• Способы создания мультилендинга
• Как сделать мультилендинг из готовой страницы
• Как повысить эффективность мультилендинга
• org/ListItem»> Заключение

Что такое мультилендинг и когда он нужен

Мультилендинг — это посадочная страница с динамическим контентом, который изменяется в зависимости от поискового запроса или набора таргетингов. С помощью такого инструмента можно сделать оффер более персонализированным, что положительно влияет на продажи.

Мультилендинг нужен, если ваша клиентура состоит из нескольких сегментов, которые приходят по разным запросам. Прежде всего подменяют заголовок, иногда подзаголовки, тексты и фото. Если сегменты ЦА сильно различаются между собой, и приходится преобразовывать практически весь контент, проще создать отдельные лендинги или страницы сайта.

Преимущества мультилендинга

По данным издания TechJury, компании с 30 и более целевыми страницами генерируют в 7 раз больше лидов, чем те, у которых меньше 10 лендингов. Причем это касается как B2B, так и B2C.

В то же время размещение нескольких предложений на целевой странице может снизить конверсию на 266%. Многочисленные предложения рассеивают внимание и, как следствие, снижают конверсию. Поэтому для каждой услуги или предложения, которые вы рекламируете, целесообразно иметь отдельную целевую страницу — или использовать мультилендинг.

Рекомендуем к прочтению:

• «Как повысить конверсию лендинга»;
• «Как увеличить конверсию интернет-магазина»;
• «Конверсия продаж: как увеличить продажи интернет-магазина»;
• «Как увеличить конверсию сайта: 20 эффективных приемов»;
• «Как и для чего отслеживать лиды с рекламы»;
• «10 способов увеличить конверсию на основе психологии».

Когда пользователь видит персонализированное предложение, возникает впечатление, что ему нужен именно этот сайт. Например, человек ищет «где лечить мальтипу» и в поисковой выдаче — а потом и на сайте — видит, что некая ветеринарная клиника специализируется на лечении конкретно этой породы. На самом деле для врачей клиники порода собак, скорее всего, не имеет значения. Но в представлении пользователя здесь знают все о мальтипу и наверняка помогут, поэтому он записывается на прием.

Мультилендинг дает больше возможностей для таргетинга. Вы сегментируете целевую аудиторию на несколько групп, и каждая из них получает наиболее релевантное предложение. При этом не нужно создавать десяток лендингов и отслеживать аналитику по каждому, что экономит деньги и время.

Кому полезен мультилендинг

Если ваша деятельность предполагает наличие нескольких групп клиентов с отличающимися запросами, стоит рассмотреть вариант мультилендинга. Скажем, если вы продаете запчасти к разным автомобильным брендам, и люди приходят по конкретным запросам вроде «запчасти рено», «запчасти тойота», полезно персонализировать заголовок.

Или для аудитории важны разные характеристики и условия получения продукта: «шкафы недорого», «шкаф-купе с бесплатной доставкой», «шкаф в детскую» и так далее — тогда для каждого сегмента стоит вынести в заголовок и подзаголовок ключевую информацию.

Иногда мультилендинг полезен при работе с разными регионами и районами. Например, для запросов про химчистку в Приморском и Малиновском районах Одессы стоит сделать отдельные заголовки.

Мультилендинг чаще всего используют в сфере услуг: ремонтные и монтажные работы, бьюти-индустрия, доставка еды и так далее. Это особенно удобно, когда услуга может называться по-разному: груминг, стрижка собак, салон для животных. Если формулировка на лендинге совпадает с запросом, вероятность заявки возрастает.

Примеры мультилендинга

Рассмотрим, как работает мультилендинг, на примере сервиса по ремонту бытовой техники.

Пользователь номер один живет в Киеве, и ему нужно отремонтировать стиральную машину Electrolux. Он вводит соответствующий запрос и видит такой лендинг:

Так выглядит страница, если посетитель указал конкретный бренд

В заголовке содержится основной запрос, в подзаголовке — информация о географии оказания услуги. Дальше перечислены преимущества: только оригинальные комплектующие, год гарантии, быстрый выезд.

Другому пользователю из Киевской области нужно починить машину LG. Он увидит такой лендинг:

Обратите внимание: в заголовке уже другой бренд

Страница выглядит точно так же — меняется только название бренда.

Третий пользователь хочет решить конкретную проблему: сбой программы стиральной машины. Он вводит соответствующий запрос — происходит подмена заголовка:

В заголовке дублируется запрос по запрашиваемой проблеме

Если человека интересует ремонт техники на Троещине, лендинг выглядит так:

В заголовке уточняется территориальное расположение

Если пользователь хочет отремонтировать холодильник, на лендинге происходит подмена заголовка и изображения под запрос:

Контент для тех, кого интересует ремонт холодильников

Таким образом, каждый пользователь видит релевантный контент, дольше остается на сайте, и вероятность конверсии возрастает.

Второй пример: SPA-салон в Чернигове, в котором оказывают весь комплекс соответствующих услуг.

Пользователь вводит «тайский массаж Чернигов» — лендинг подстраивается под запрос:

В заголовке конкретная услуга

В заголовке содержится информация из запроса, в подзаголовке перечислены основные преимущества.

Другого пользователя интересует массаж лица. В запросе не указан конкретный вид, поэтому заголовок сообщает, что в салоне делают массаж в любой технике. Подзаголовок не меняется — в данном случае важны те же преимущества.

Меняется заголовок

Третий пользователь ищет SPA-салон в Чернигове. Это общий запрос, из которого неясно, что именно интересует потенциального клиента. Поэтому в заголовок переносится запрос, а подзаголовок охватывает все возможные микросегменты аудитории.

В SPA-салоне доступны все виды услуг, и на мультилендинге это обозначено

Как подготовиться к созданию мультилендинга

Первый шаг при создании любого сайта — изучение ЦА. Чтобы сформулировать УТП и оффер, важно понимать, кто наши клиенты и каким они хотят видеть продукт.

Рекомендуем к прочтению! Узнайте, как составить продающий оффер правильно: пошаговая инструкция.

Допустим, мы продаем курсы нутрициологии. Можно выделить следующие сегменты ЦА:

1. Проходят курсы для себя, чтобы использовать полученные знания в жизни.
2. Изучают новую специальность, чтобы стать профессиональным нутрициологом.
3. Ищут подарок другому человеку, сами не интересуются темой.

В каждом из этих случаев поисковый запрос чаще всего выглядит как «курсы нутрициологии». По нему сложно определить, к какому сегменту относится пользователь. Точные запросы тоже бывают, но гораздо реже, а основной трафик идет с общих фраз.

К тому же, в некоторых сферах практически невозможно выделить сегменты аудитории на основании того, кем является клиент. В таких ситуациях фокус смещается на сам продукт — для чего он нужен, какие характеристики являются ключевыми.

Если вашу целевую аудиторию можно поделить на конкретные сегменты, составляйте подробные портреты клиентов. Другой вариант — обозначить наиболее важные характеристики продукта и возможные возражения. Особенно обратите внимание на то, чем чаще всего недовольны люди — это ваш шанс превзойти конкурентов.

Источники информации:

• интервью и опросы представителей ЦА;
• разговоры и переписки менеджеров с клиентами;
• комментарии в тематических сообществах в соцсетях, мессенджерах и на YouTube-каналах;
• сайты с отзывами и обзорами;
• сайты и соцсети конкурентов.

На основе полученных сведений составьте таблицу с четырьмя колонками:

1. Ключевые факторы, на которые смотрят покупатели.
2. Свойства вашего товара или услуги, которые соотносятся с факторами из предыдущей колонки.
3. Выгода, которую получит клиент от покупки.
4. Статус каждого из факторов от «менее важно» до «очень важно».

Советуем ознакомиться! Узнайте, как создавать ценность для клиента и выигрывать конкуренцию.

Ниже пример такой таблицы для агентства, которое создает сайты для бизнеса, где указаны потребности клиентов и возможности компании:

Фактор	Свойство	Выгода	Статус
Скорость выполнения работы	Быстро: от двух недель до месяца	Можно делать продажи с сайта через месяц или раньше	Важно
Опыт, наличие кейсов	Команда опытных специалистов, множество довольных клиентов	Гарантированное качество	Очень важно
Возможность реализации требуемых функций	Реализуем проекты любой сложности	Сайт отвечает всем целям клиента	Очень важно
Удобство интерфейса для пользователей	С учетом особенностей проекта создаем user frendly интерфейсы	Меньше потерь клиентов	Очень важно
Отсутствие багов	Досконально проверяем корректность работы	Меньше потерь клиентов	Очень важно
Современный привлекательный дизайн	Знаем и учитываем тренды в дизайне	Поможем выделиться среди конкурентов	Важно
Адаптивность	Всегда адаптивные сайты	Удобство для клиентов на любых устройства	Очень важно
Цена	По сравнению с крупными конкурентами недорого, оговаривается	Экономия при достойном качестве	Важно

Теперь нужно сделать прототип лендинга на основе информации выше.

Содержимое первого экрана должно доносить до посетителей суть вашего предложения. В заголовке и подзаголовке сформулируйте УТП из главных выгод. Разместите призыв к действию: оставить заявку, заказать обратный звонок, написать в мессенджер.

Заголовок и подзаголовок полностью выражают УТП

На следующих экранах информация располагается в порядке уменьшения значимости. Она должна отвечать на возражения и усиливать впечатление о пользе продукта для клиента.

Лендинг — это легко!

Создавайте красивый и адаптивный дизайн без погружения в технические настройки!

Как сделать мультилендинг с нуля

Рассказываем об этапах создания мультилендинга с нуля.

Создайте исходный лендинг

Сначала необходимо сделать посадочную страницу с контентом, который подходит всем сегментам ЦА. Можно нанять программистов и дизайнеров, но это дорогостоящий вариант, оправданный для крупных компаний или в люксовых нишах — ювелирные украшения, элитная недвижимость, автомобили премиум-класса и тому подобное. Значительно дешевле и быстрее использовать конструктор сайтов.

Рекомендуем к прочтению:

• «Как разработать дизайн сайта»;
• «Круг Иттена для качественного дизайна»;
• «Мобильная версия сайта — пошаговое создание».

В SendPulse есть конструктор для создания сайтов, лендингов и мультиссылок. Можно выбрать один из 19 шаблонов, которые подходят для любых целей, или создать полностью уникальный дизайн. Конструктор позволяет добавлять изображения и видео, размещать кнопки мессенджеров или мультиканальный виджет подписки на email, SMS и чат-боты, а также принимать оплату через PayPal, Fondy и другие платежные системы.

Пример лендинга, сделанного в конструкторе SendPulse

Можно подключить собственный домен: SSL-сертификат генерируется автоматически. Настройки SEO-оптимизации позволяют улучшать позиции вашего сайта в выдаче поисковиков. Есть интеграция с Google Analytics и внутренняя статистика.

Внутренняя статистика сервиса

Чтобы запустить таргетированную рекламу в Facebook и Instagram и не бояться блокировки, необходимо выполнить верификацию домена в Facebook Business Manager через метатег — в конструкторе SendPulse это сделать очень просто. Чтобы измерить эффективность рекламы, добавьте пиксель FB по инструкции.

Также вы можете встраивать пользовательский код ви— скажем, когда нужно добавить на сайт виджет или дополнительные события для аналитики. Есть таймер обратного отсчета и раздел FAQ в формате «аккордеона».

Пример раздела FAQ

Конструктор интегрируется со всеми нашими инструментами, включая CRM и сервис web push уведомлений, а также позволяет сгенерировать и сохранить QR-код сайта.

Решите, какие элементы будете подменять

На следующем шаге определите, какие элементы подлежат подмене.

Нужно отработать всю связку: ключевая фраза или группа фраз — объявление — оффер на посадочной странице. Это позволяет персонализировать предложения в рекламных объявлениях и на сайте, благодаря чему повышается конверсия.

Алгоритм действий выглядит так:

1. Делим ЦА на микросегменты на основе ключевых фраз или таргетингов.
2. Создаем УТП для каждого микросегмента.
3. Используя подмену контента, настраиваем для представителей каждого сегмента показ соответствующего УТП на одной и той же посадочной странице.

Микросегменты можно выделить по разным основаниям: цена, местоположение, время выполнения или доставки, конкретный производитель и многое другое.

На мультилендинге всегда подменяем заголовок, а остальные элементы — индивидуально для разных случаев. Исходите из особенностей своего проекта.

Сегментируйте запросы

Все поисковые запросы распределяем по 12 группам:

1. Указание продукта. Запрос содержит только название товара или услуги, без каких-либо дополнительных параметров: «курсы SMM», «спортивный костюм», «проведение воды в дом».
2. Готовность к покупке. Такие запросы выражают желание приобрести продукт или заказать услугу: «купить ноутбук», «вызвать клининг».
3. Цены. Пользователь интересуется стоимостью продукта: «клининг цена за м2», «сколько стоит установка кондиционера», «расчет стоимости окна», «недорогой смартфон», «роллы по акции».
4. Характеристики продукта. Размер, жесткость, мощность, вместимость, цвет и так далее: «кровать двуспальная», «черное платье», «мягкий матрас», «винтажные очки».
5. Указание на место или область применения: «водопровод в частный дом», «таблетки от кашля для детей», «часы в подарок», «костюм для фитнеса».
6. Особые условия покупки: «курсы дизайна интерьера в кредит», «айфон в рассрочку», «ресторан с доставкой».
7. Место покупки: «свадебное платье салон», «интернет-магазин кондитера», «студия эпиляции».
8. Геолокация: «свадебное платье Николаев», «установка дверей Алматы».
9. Обслуживание: «ремонт ноутбука», «установка сигнализации», «монтаж теплого пола».
10. Оптово-производственные запросы: «посуда оптом», «изготовление ключей», «производство мебели».
11. Упоминание бренда: «ремонт макбука», «запчасти для тойота камри», «духи том форд».
12. Прочие. Сюда относятся запросы, которые не входят ни в одну из групп выше: «духи оригинал или подделка», «ремонт телефона своими руками», «посудомойка отзывы».

Некоторые запросы одновременно относятся к нескольким сегментам, и важно определить, какой элемент для пользователя ключевой. В примере «наушники airpods pro цена» главное — указание бренда, поэтому запрос включается в соответствующую группу.

Микросегменты можно раздробить на группы еще меньше. Каждое свойство, бренд, место покупки и так далее станут отдельным сегментом, каждый из которых выражает одну конкретную потребность.

Как дробить микросегменты на группы еще мельче

Под каждый микросегмент формируем персональное УТП. Можно составить его под каждую группу объявлений в рекламной кампании. А если одной поисковой фразе соответствует одно объявление, нужно объединить сходные по смыслу ключевики. Например, запросы «поставить брекеты цена» и «сколько стоит установка брекетов» несут один смысл.

Здесь нужно обратиться к таблице, которую составляли ранее — с факторами, свойствами и выгодами. С опорой на нее оставляем предложения для разных групп.

Если фразы слишком общие, нужно добавить максимум подробностей в подзаголовок. Основная структура для ценностного предложения: продукт плюс две выгоды.

Как можно сформулировать предложение

Далее переходим к настройкам подмены динамических элементов, после чего можно запускать рекламную кампанию. Ниже мы подробно разберем способы создания мультилендинга.

Рекомендуем подборку статей про составление SEO-текстов, сбор семантики и продвижение сайтов:

• «SEO копирайтинг — что это и как он поможет сократить затраты на продвижение»;
• «SEO инструменты, которые сэкономят ваше время — подборка»;
• «Как LSI копирайтинг поможет вывести сайт в топ и почему он лучше обычного SEO»;
• «Что такое релевантность страницы сайта и как ее определить»;
• «Как поднять сайт в поиске и получать лиды почти бесплатно».

Как сделать мультилендинг из готовой страницы

Чтобы настроить подмену контента на готовом сайте, используйте копирование страниц, настройку через Google Tag Manager или персонализацию в Google Optimize. В следующем разделе рассмотрим все эти варианты.

Также существуют скрипты для превращения посадочной страницы в мультилендинг, которые можно найти в интернете, но это способ для продвинутых пользователей.

Способы создания мультилендинга

Сделать мультилендинг можно разными способами. Расскажем о наиболее популярных.

Конструкторы

В некоторых конструкторах сайтов, например, Wix, предусмотрено добавление динамического контента.

Чтобы сделать мультилендинг в Wix, нужно создать сайт на платформе, добавить Менеджер контента, создать свою коллекцию и настроить динамические страницы. Подробную инструкцию читайте в справке сервиса.

Добавление Менеджера контента в Wix

Копирование страниц

Простой вариант для сайтов на WordPress. Необходимо добавить плагин Duplicate Post, с помощью которого можно дублировать страницы.

Скопируйте страницу в поддомен или папку и затем изменяйте контент под различные сегменты аудитории. Чтобы не было проблем с SEO-продвижением сайта, запретите индексацию для страниц-дублей.

Выбор элементов для копирования. Источник

 

Google Tag Manager

Создайте аккаунт в Google Tag Manager, выберите целевую платформу — в данном случае веб-сайт. Диспетчер тегов создаст два фрагмента кода, которые нужно вставить на вашем сайте в разделыисоответственно.

Фрагменты кода для установки GTM на сайт

В рабочей области создаем триггер, как показано на скриншоте.

Создание триггера

Даем название триггеру и выбираем тип «Просмотр страницы».

Выбор типа триггера

Настраиваем условие для срабатывания триггера, как на скриншоте. В третьем поле пишем понятную метку, которая будет указана в ссылке на лендинг.

Настройка условия для активации триггера

Создаем тег в рабочей области.

Создание тега

Выбираем тип «Пользовательский HTML».

Выбор типа тега

В окне вводим нужный скрипт. Например, так выглядит код для изменения заголовка:

Скрипт для подмены заголовка

Ниже выбираем созданный ранее триггер. Сохраняем и нажимаем «Опубликовать».

Чтобы срабатывал скрипт, нужно к ссылке на сайт добавить метку-условие. В нашем случае это dynamic_header: http://домен/?dynamic_header. Также ее можно использовать с utm-метками.

Google Optimize

Это бесплатный сервис для оптимизации сайтов, с помощью которого можно проводить A/B тесты и другие эксперименты, а также выполнять персонализацию контента.

Заведите аккаунт в сервисе и начните проект оптимизации: укажите название, URL-адрес, выберите пункт «Персонализация» и нажмите «Создать».

Начните проект оптимизации

На странице проекта нажмите «Изменить сайт».

Нажмите на кнопку

Откроется окно редактирования исходного сайта. Здесь можно изменять, добавлять и удалять HTML и текст, запускать JavaScript.

Окно редактора сайта

Нам нужно поменять заголовок — выделяем элемент h2, выбираем «Изменить HTML» и редактируем текст. Нажимаем «Применить».

Изменение заголовка

В редакторе можно посмотреть, как выглядит сайт на разных устройствах. Когда изменения внесены, нажмите «Готово».

Теперь нужно задать условие для проведения эксперимента. В разделе «Таргетинг на страницы» указываем, что URL содержит метку, например, dynamic_content или URL соответствует https://домен/dynamic_content.

Задаем условие для подмены контента

Также можно использовать utm-метки, настраивать таргетинг на пользователей разных устройств, из определенных городов и регионов или выбрать другой доступный вариант из списка.

Правила выбора целевой аудитории

Далее нужно подключить Google Analytics для сбора данных и установить код оптимизации на сайт — в сервисе есть инструкции. Теперь можно запускать эксперимент и при необходимости вносить новые изменения.

Как сделать мультилендинг из готовой страницы

Чтобы настроить подмену контента на готовом сайте, используйте один из рассмотренных вариантов: копирование страниц, настройка через Google Tag Manager, персонализация в Google Optimize.

Также существуют скрипты для превращения посадочной страницы в мультилендинг, которые можно найти в интернете, но это способ для продвинутых пользователей.

Как повысить эффективность мультилендинга

Напоследок несколько советов о том, как сделать мультилендинг эффективнее.

1. Просто копировать запрос и вставить в заголовок — не лучшая идея. Составьте полноценные предложения для микросегментов ЦА с учетом факторов, которые влияют на принятие решения.
2. В потребность микросегмента легче попасть. Чем уже сегмент ЦА, под который вы составляете УТП, тем выше вероятность конверсии.
3. Заголовок и призыв к действию — главные конверсионные элементы, поэтому акцентируйте на них внимание.
4. Проведите исследование и выясните истинные потребности посетителей, которые приходят по определенным запросам. Узнайте, на что они обращают внимание, что влияет на принятие решений.
5. Используйте геотаргетинг — подстановка соответствующего контента в зависимости от того, где находится посетитель сайта. Можно заменять заголовок и подзаголовок, адрес и телефон, изображения — иногда это влияет на конверсию.
6. Проверяйте гипотезы об эффективности разных вариантов лендинга с помощью A/B тестов. Анализируйте конверсии по каждой группе поисковых фраз или таргетингов.
7. Все конверсионные элементы необходимо согласовать друг с другом. Например, изначально через сайт продавали только суши, а потом добавили пиццу и лапшу. Пользователь искал пиццу — заголовок и изображение соответствуют запросу, а на кнопке осталась надпись «Заказать суши». Таких ситуаций быть не должно.

Заключение

Мы разобрали, что такое мультилендинг, кому он полезен и как его сделать. Создавайте лендинги в конструкторе SendPulse и подменяйте контент одним из перечисленных способов.

Рекомендуем попробовать другие наши инструменты: платформу для создания онлайн-курсов, сервисы email, Viber и SMS рассылок, чат-боты для мессенджеров, бесплатную CRM и web push уведомления.

Что такое мультилендинг? Примеры и сравнение сервисов

16 ноября Создание сайта

Содержание:

Маркетологи давно доказали эффективность лендингов. Но есть функция, в несколько раз повышающая эффект от обычного одностраничного сайта – это мультилендинг. Он позволяет показывать посетителям сайта именно ту информацию, которая их интересует. Благодаря такому инструменту, конверсия сайта увеличивается в разы.

Что такое мультилендинг?

Это лендинг, на котором разные элементы показываются для разных посетителей. В первую очередь подменяются оффер, заголовки, товар/услуги. Как определяется контент для того или иного визита? Все просто: трафик делится на сегменты по каким-то признакам. Администратор сайта задает, какой контент показывать тому или иному визиту.

Другое название метода — динамический контент. Это более обобщенное понятие. Так называют, например, изменяемые цены на сайтах авиабилетов. Когда пользователь Macbook видит цены выше, чем пользователь старого девайса на Android. Или дешевеющие нераспроданные гостиницы на Booking.com.

Примеры

Допустим, вы занимаетесь продажей цветов. У вас есть три клиента. При переходе на ваш сайт первый посетитель видит оформление в виде роз, второй – в виде лаванд, третий – в виде тюльпанов. Все пришли из Яндекс Директ, но по разным запросам.. Первый искал розы, второй – лаванды, третий, соответственно, тюльпаны.

Чем объясняется повышение конверсии?

• Фокус на одном товаре
• «О, акция именно на то, что я искал»
• Релевантность посадочной страницы запросу

Как создать мультилендинг?

Сейчас рассмотрим общий принцип создания посадочных страниц с динамическим контентом, а после перейдем к сервисам с таким функционалом.

1. Создаём основную страницу – главную – на которую будут попадать пользователи, не принадлежащие ни к одной группе. Будем использовать е в качестве шаблона для других страниц мультилендинга.
2. Рекламируем. Предпочтительный канал выбирать вам: Google Adwords, Яндекс.Директ, социальные сети, сайты-партнеры или другие.
3. Когда сайт готов, выбираем варианты оформления страниц под целевые запросы. К примеру, платформа LP позволяет это сделать в специальном редакторе.
4. Запускаете станицу. Теперь пользователь, перешедший по определенному запросу, будет видеть соответствующую его интересу информацию.

Сервисы

Примеры инструментов, с помощью которых можно реализовать динамический контент на сайте. Мы рассмотрим отдельные сервисы и конструкторы сайтов со встроенным мультилендингом.

Гиперсегментация с Yagla

Наверное, самый известный сервис для создания мультилендингов. Они называют это гиперсегментацией трафика. «Ягла» подключается к уже созданному сайту. Есть интеграции с большинством топовых конструкторов сайтов и CMS. Из интересных особенностей: подключение рекламных кабинетов Яндекс Директ, Google Ads, MyTarget по API. Что это нам дает? — Настройку сегментов по рекламным кампаниям, группам и объявлениям прямо в интерфейсей Yagla. Очень удобно. Обзор и промокод для «Яглы».

PlatformaLP

Конструктор лендингов со встроенной функцией подмены контента. Параметр передается через UTM-метку (см.ниже). Контент для замены указывается прямо в конструкторе.

С сайта ПлатформыЛП

Tilda

В красивом конструкторе посадочных страниц «Тилда» тоже можно делать подмену контента внутри блоков по параметрам в URL адресе. Здесь можно прочесть подробную инструкцию. Из других прикольных функций здесь можно найти персонализацию контента по гео-данным (геолендинг) и языковам настройкам браузера.

С сайта Tilda

LpMotor

Данный конструктор сайтов пошел по простому пути интеграции с Yagla. Вот подробный обзор создания адаптивного контента в Моторе.

Мультилендинг на WordPress

Как вы уже поняли, на любой CMS можно сделать адаптивный контент с помощью все той же «Яглы». Если хочется бесплатно, то есть вот такие самописные PHP-скрипты для реализации подмены. С помощью простого скрипта можно сделать мультилендинг даже на самописном сайте или на любой экзотичной CMS.

Сегментация с помощью UTM-меток

Предположим, вы рассортировали пользователей на группы на бумаге. Как определить к какой группе принадлежит посетитель, зашедший на ваш сайт? Для этого существуют UTM метки – дополнительные символы, размещенные в ссылке.

Ссылка N1: https://ru.wikipedia.org/wiki

Ссылка N2: https://ru.wikipedia.org/wiki/?utm_source=google

Две эти ссылки ведут на одну и ту же страницу, но вторая несет информацию, откуда пользовать перешел на данный ресурс. В данном случае можно узнать, что посетитель перешел на сайт из поисковой системы Гугл.

Существует параметров, которые можно передавать в UTM-метках, вот базовые:

• utm_term – ключевые фразы
• utm_campaign – обозначение рекламной компании;
• utm_source – несет информацию об источнике, с которого пользователь попал на сайт;
• utm_medium – информация о формате размещения, к примеру, баннере;
• utm_content – информация о кампании, ее особенности, цель.

При создании мультилендинга применяется метка utm_term. Когда вы настроили страницу и запускаете ее работу, к примеру, приглашаете на спортивные мероприятия, вы прописываете список ключевых слов и фраз в ссылке utm_term. Благодаря этому, каждая группа посетителей будет видеть интересный для себя контент.

Еще один пример

Компания «SecondAvto» занимается продажей подержанных российских машин. Размещает на сайте запись «Продажа отечественных б/у машин в Ростове и области». Есть покупатели, которые еще не определились с выбором – для них есть основная страница с общей информацией. Они находят ее по запросу «купить авто в Ростове». Но есть те, которые ищут определенный автомобиль. Именно для них можно прописать utm_term для каждой модели.

Теперь пользователь, ищущий автомобиль ВАЗ 2107 попадет на целевую страницу сайта, где представлена информация именно об этой машине.

Не забывайте об А-Б тестированиях…

На последок хочется сказать, что используя мульти лендинги и адаптивный контент, не стоит забывать о классических А-Б тестированиях. Порой, несколько быстрых тестов приводят к значительному росту конверсии. А еще лучше, совмещать эти инструменты.

Метки поста: Landing page, Динамический контент, Увеличение конверсии

Мультилендинг.

Что такое и как его создать.

Основной задачей рекламодателя, который продвигает свои товары или услуги в интернете (да и не только в интернете), является повышение эффективности его рекламной кампании. Необходимо снижать расходы на привлечение клиентов, повышать конверсию сайта. Для этого нужно отсечь нецелевых пользователей и ориентироваться только на тех, кому будет интересен предлагаемый товар или услуга. Для фокусировки на своих целевых группах компании могут использовать новую технологию создания одностраничников – мультилендинг.

Что такое мультилендинг

Мультилендингом называется посадочная страница с адаптивным контентом. На таком лендинге содержание меняется в зависимости от поискового запроса и от рекламного объявления, по которому кликнул пользователь, чтобы перейти на сайт рекламодателя. Такой веб-ресурс таргетируется на конкретные целевые группы, что позволяет обеспечить высокую конверсию.

По сравнению со стандартным лендингом, который показывает конверсию 3-10% (в зависимости от сферы бизнеса и эффективности раскрутки), мультилендинги показывают значения в 3-4 раза выше. Такая эффективность обусловлена тем, что посетителю показывают предложение, которое с высокой вероятностью может заинтересовать его (т.к. контент сайта отображает информацию релевантную поисковому запросу).

Мультилендинг будет хорошим вариантом для компаний, которые реализуют несколько групп товаров или разные услуги, запуская рекламные кампании с различными настройками геолокации. Для фирм с большим ассортиментом разных видов продукции лучше создавать и продвигать многофункциональный интернет-магазин.

Пример реализации мультилендинга

При разработке мультилендинга нужно четко понимать свою целевую аудиторию, ее предпочтения и мотивацию к покупке. Если для ЦА важным показателем при выборе поставщика является местоположение, значит, нужно использовать настройки геотаргетинга, показывая людям интересующий их город, район или улицу.

Пример 1

Потребитель, который живет в Дмитровском районе Москвы, хочет заказать ремонт стиральной машины. С большой вероятностью, он будет вводить в поисковую строку «Ремонт стиральной машины Дмитровский район Москва» (т. к. не будет ехать через весь город для заказа такой услуги, а найдет подрядчика в своем районе). Если задать настройки страницы под этот запрос, то пользователь увидит лендинг, где предлагается ремонт именно в этом районе. А если другой пользователь введет подобный запрос, но уже с упоминанием, к примеру, Замоскворечья, он тоже попадет на тот же сайт, но уже предлагающий сервис в Замоскворечье.

Пример 2

Небольшая компания занимается созданием и продажей фотокниг. Весь трафик из поисковых систем идет на небольшой сайт-одностраничник, где всем посетителям показывается общее предложение о заказе фотокниг с доставкой по всей России.

Если сегментировать трафик по видам книг и по региону доставки и превратить обычный сайт в мультилендинг можно добиться конверсии из посетителя в лида до 60%. Предположим, пользователь вводит в Яндексе запрос “Детские фотокниги Казань”, попадает на сайт и видит информацию именно о детских фотокнигах, которые могут быть доставлены в Казань. Естественно он акцентирует свое внимание именно на этом сайте и более подробно ознакомится с информацией на нем. Аналогичная ситуация развернется и для пользователя, вводившего, например, “Семейные фотокниги Екатеринбург”. Здесь для большего эффекта помимо заголовка подменяется и основное изображение на сайте.

Какие преимущества дает использование мультилендинга

Создание мультилендинга выгодно и оправдано, т.к. персонализированное предложение всегда более эффективно.

Какие выгоды получает владелец мультилендинга:

• Повышение конверсии ресурса. Это значит, что вы будете меньше платить за привлечение каждого нового покупателя, т.к. общие затраты на рекламу распределяются на большее количество клиентов.
• Увеличение лояльности к продвигаемым брендам и компании. Когда пользователь видит предложение, словно специально составленное именно для него, уровень его доверия и лояльности повышается.
• Увеличение рейтинга лендинга. Количество отказов (например, из-за того, что пользователь не находит на странице то, что ищет) приводит к снижению рейтинга при ранжировании поисковыми системами. Если отказов мало и конверсия ресурса высокая, поисковики оценивают это, как значимый положительный фактор.

Создание мультилендинга с сервисом reked.ru

Если у Вас уже есть созданный сайт, то вы можете воспользоваться нашим сервисом Reked для того, чтобы превратить его в мультилендинг. Все довольно просто:

• Загружаете рекламную кампанию из Яндекс Директа или Google Ads
• Выбираете на сайте элементы, которые будут подменяться
• И настраиваете элементы под каждое рекламное объявление

Ознакомиться с нашим сервисом и попробовать его в деле можно бесплатно. 30 дней использования предоставляются Вам на ознакомление. Переходите на наш сайт reked.ru, регистрируйтесь, оптимизируйте настройки и наблюдайте как растет конверсия!

как удивить пользователя, предложив ему то, что он ищет. Что такое мультилендинг

В этой статье, мы рассмотрим инструмент, который будет подменять текст на сайте в зависимости от запроса пользователя. Мы будем делать, так называемый мультилендинг, то есть подмену текста на сайте, сервисом ЯГЛА .

Как работает сервис:

Например, если человек ввёл фразу в поиске «Купить дом», а вы на сайте, рекламируете и квартиры, и дома, и участки, и т.д., то соответственно целесообразнее, будет этому человеку, показывать страницу только с домами, так как он не ищет ничего остального. Если человек увидит на странице информацию по домам, то вероятнее, он оставит заявку, чем если он увидит квартиры. Подмена текста на сайте, повышает конверсию сайта.

Пример:

Вот заголовок на моём сайте «Настройка и ведение контекстной рекламы»

Такой заголовок будет показан всем, по какому бы запросу человек не пришел. Соответственно, меня это не устраивает, и я буду делать подмену заголовка под каждый запрос.

Например, в моей кампании яндекс директа, есть запрос «Настройка яндекс директ Краснодар».

Соответственно, если человек будет заходить на сайт по этому запросу, то не совсем рентабельно будет ему показывать стандартный заголовок о настройке контекстной рекламы. Лучше воспользоваться подменой текста на сайте, и написать более конверсионный заголовок. Как в примере ниже:

Это конечно не идеальный заголовок, но я даю вам информацию в качестве примера. А дальше, уже пусть работает ваше творчество.

Главное, чтобы пользователю был дан точный ответ на его вопрос. В моём случае, человек ищет услуги именно по Краснодару, а мы ему как раз и показываем этот город и фразу.

Как настроить подмену текста на сайте

Первым делом регистрируемся в сервисе по ссылке ЯГЛА .

Когда вы уже зарегистрировались, входим на сайт под своим логином и паролем.

У вас откроется начальный интерфейс для настройки сервиса.

Нам нужно выбрать подменяемые элементы. У вас откроется страница вашего сайта в системе, и нужно нажать на элемент, который будет подменяться. В качестве примера, я покажу вам подмену только на заголовках, а вы уже потом сможете доработать любой элемент на вашем сайте, вплоть до логотипа. Когда выбрали элемент, нажимаем «Да, сделать подменяемым».

Как работает подмена текста в системе

Обратите внимание, что настройка подмен делается только для групп объявлений. В моём примере, реклама настроена по структуре 1 ключ = 1 объявление, поэтому я могу делать подмену текста для всех ключей. Если же у вас много ключей в одной группе, то вы сможете сделать подмену текста только для группы. Выход из этого положения такой: делайте ключевые запросы в группе, которые схожие по названию (отражают одно и то же).

Вставляете свои заголовки в поле для заголовков, и нажимаете «Сохранить». Теперь подмена текста на сайте у вас работает. Осталось только установить код на сайт, и запускать рекламу.

Если вам не совсем понятно, как сделать подмену текста на сайте (мультилендинг), то более подробно, я рассматриваю этот момент в видео:

Желаю вам удачи и бесконечного потока лидов. С вами был Михаил Антонов. Обращайтесь за настройкой и оптимизацией ко мне, и делайте репосты статьей!

Эффективность лендингов достигается прежде всего за счет его жесткой структуры и акцента на конкретном предложении. Одностраничный сайт плохо будет продавать несколько разных товаров или услуг, он вряд ли заменит полноценный интернет-магазин, и не всегда такую посадочную страницу можно приспособить под несколько категорий покупателей, потому что у каждой могут быть свои интересы, и осветить их все на одной странице можно, но придется поплатиться легкостью восприятия информации, что на конверсии плохо скажется. Какой выход, если нужно достичь сразу нескольких целей? Сделать несколько лендингов? Можно, но дорого. Есть вариант поизобретательнее — мультилендинг.

Что такое мультилендинг

Мультилендинг — это , контент на которой является динамическим, то есть он изменяется в зависимости от того, какой посетитель на нее попал.

Что на мультилендинге может подстраиваться под пользователя? Да все, что угодно:

• тексты
• оффер
• контактные данные
• изображения
• целые блоки и т.д.

Примеры, когда можно использовать мультилендинг

Вы занимаетесь услугами по подбору авто. Главные сегменты ваших пользователей: подбор авто эконом класса, среднего и элитного-варианта. Если человек хочет дорогую машину, интересно ли ему будет на сайте смотреть картинки бюджетных машин отечественного производства? Нет, ему будут показаны фото дорогих авто и оффер будет делать акцент на элитном сегменте.

У вас есть несколько классов по курсам иностранного языка, который расположены в разных уголках большого города. Если человек, когда искал в Яндексе курсы в своем районе, увидит слишком далекий от него адрес, то он даже не будет интересовать вашим предложением. Если же вы сразу, на главном экране укажете адрес, который ему ближе всего, вероятность того, что он задержится на странице гораздо выше.

Вы занимаетесь отделкой домов и квартир. Если вас ищут в контекстной рекламе, то в заголовке можно указать только квартиры, совсем не упоминая коттеджи. И наоборот.

Надо отметить, что целесообразность создания мультилендинга существует не всегда. Разрабатывать мультилендинг вам совершенно не нужно , если:

• Вы не собираетесь вести на него трафик из
• Ваша целевая аудитория однородна и нет смысла дробить ее на мелкие сегменты
• Товары или услуги, которые вы продаете на лендинге очень близки друг к другу и все могут пригодиться любому вашему посетителю

Как сделать мультилендинг

Существует три основных способа для создания динамического лендинга. Нельзя однозначно сказать, какой из них лучше или хуже, все зависит от конкретных целей лендинга.

1. Вставка скрипта. На сайт нужно вставить специальный скрипт, который будет менять контент в зависимости от запроса пользователя. Делается это за счет связи с UTM-метками. Например, в оффер можно полностью вставить ключевой запрос.
2. Создание нескольких лендингов. Речь идет не о кардинально отличающихся друг от друга страницах, а о лендингах с минимальными изменениями. Типичный пример – разнесенные по поддоменам страницы, с таргетингом на разные города. Весь контент будет идентичными, но заголовок и контактные данные будут отличаться.
3. Использование сервисов по созданию мультилендингов. Существует ряд специальных сервисов, которые помогают быстро и удобно сделать мультилендинги (конечно, не бесплатно), при этом обладают разными полезными функциями, существенно расширяющими ваши возможности. Пару вариантов таких сервисов: Yagla или PPC-help .

До того, как создавать мультилендинг, подумайте, насколько он вам необходим, и что для этого может понадобиться. С одной стороны, вам может понадобиться помощь программиста, если вы хотите внедрять специальные скрипты, с другой стороны, нужно будет провести исследование аудитории и понять, насколько использование динамического контента целесообразно. Если же исследование вы уже провели и знаете, как можно использовать мультилендинги в своих целях, то составляйте предложения для каждой группы посетителей и начинайте тесты!

Мультилендинги уже как лет 5 «ходят» в ведущих трендах интернет-маркетинга. При этом нет единой трактовки, что это такое. Существует несколько подходов с разными принципами работы и разным эффектом.

В этой статье вы узнаете о технологии адаптивного контента. Это подстройка заголовка, подзаголовка, текста в лид-форме под запросы пользователей на одной и той же странице. В чем преимущества мультилендингов с адаптивным контентом по сравнению с прочими способами?

Персонализированный маркетинг

Для начала вспомним, с чего все началось. На Западе о персонализации и релевантности заговорили 5-6 лет назад. Явный эффект был отмечен в email-маркетинге. и отправка каждой группе узкоцелевых сообщений приносила увеличение показателей open rate (открываемости писем) и click rate (переходы по ссылкам) как минимум на 75-80%.

Для квалификации подписчиков стали внедрять сложные скрипты. Впрочем, затраты того стоили. Результативность контента «один на всех» чем дальше, тем больше стремилась к нулю.

Следующим этапом стал геотаргетинг на веб-ресурсах. Методика особенно эффективна для интернет-магазинов и крупных брендов с сетью филиалов. Город автоматически определяется по IP-адресу, и посетитель видит, например, заголовок «продажа камер GoPro в Екатеринбурге».

Известный эксперт e-commerce Нил Патель за счет геотаргетированного оффера на своем сервисе Quicksprout.com получил на 68% больше лидов.

Правило точного вхождения

В контекстной рекламе к переходам мотивирует привлекательное объявление. Но если человек кликнул, например, на «снегоходы в Рязани со скидкой 15%», а попал на главную страницу компании по продаже мототехники, то даже супер-объявление будет «мимо кассы».

Точное соответствие запроса тому, что пользователь видит на посадочной странице, повышает ее конверсию. Это принцип релевантности. На самом деле, обычная психология: мы лояльнее относимся к тому, что как-то с нами связано.

Сервис A/B тестирования Optimizely увеличил конверсию на 39% после того, как сделал 3 лендинга под 3 разных объявления в Google.

Вариант 1. Все объявления ведут на одну и ту же страницу:

Вариант 2. Каждое объявление ведет на отдельную страницу

По сути, это многократное дублирование одного шаблона с разными заголовками, под отдельными URL-адресами. И здесь возникает ряд вопросов:

• Страницы создаются на специальной платформе. Как быть тем, у кого уже есть сайт на другой CMS?
• Обязательно создавать сотни страниц под каждое объявление?
• Как синхронизировать подмены с рекламной кампанией в Яндекс.Директ?
• Как протестировать и сравнить эффективность всех вариантов?

Посмотрим, как их решает сервис адаптивного контента Yagla.

Мультилендинги с адаптивным контентом

Вместо сотен дублей гораздо удобнее настроить автоматическую подмену заголовка, подзаголовка, подписи в форме захвата и части изображений на одной и той же странице. Контент меняется в зависимости от запроса пользователя.

Одну и ту же услугу люди называют по-разному:

Запрос «Продвижение сайтов »

Запрос «Увеличение посещаемости сайта »

У продукта разные варианты использования, комплектация или условия покупки:

Запрос «Пластиковые окна на дачу »

Запрос «Пластиковые окна в рассрочку »

Всем привет. Недавно я писал статью, о том, к заявке на landing page. По факту, мы получали данные UTM из адресной строки, запоминали их в скрытых полях и передавали в обработчик, как и данные из обычных полей.

Подобным образом можно менять контент на странице, в зависимости от того, по какой фразе к нам пришел посетитель. Сейчас, сайт с такой функцией называют мультилендинг, и сегодня мы разберем php скрипт который поможет нам реализовать такой функционал на своем landing page.

Давайте наконец разбираться, как же сделать мультилендинг самостоятельно, без использования сторонних сервисов, за которые нужно платить деньги. Кстати, если надумаете внедрять, пожалуйста, поделитесь потом результатами конверсии. Буду очень признателен за скриншоты в духе «До/После» и если хотите, разместим скрин вместе со ссылкой на ваш лендинг в конце статьи как доказательство работоспособности инструмента. Думаю, это пойдет только в плюс вашему проекту (лишняя естественная ссылка).

Итак, для работы нам понадобится php, а значит, в случае необходимости, нужно переименовать вашу главную страницу с index.html в index.php. Это никак не повлияет на работоспособность лендинга.

Теперь, давайте поставим себе задачу. Допустим я хочу, чтобы у меня на лендинге менялся заголовок в зависимости от запроса. Например, я подобрал такие запросы:

• Верстка landing page
• Разработка landing page

И хочу, чтобы пользователям, при переходе по конкретному запросу, показывался наиболее релевантный заголовок. Давайте под каждый запрос создадим ссылку с . Ориентироваться будем на параметр «utm_content» (Вы можете выбрать любой).

Итак, для запроса « » — utm_content=sozdanie, для «Верстка landing page» — utm_content=verstka, а для «Разработка landing page» — utm_content=razrabotka.

Теперь приведу сам php скрипт:

Как видите, при помощи _Get запроса ловим нужные нам данные (utm_content или любой другой интересующий нас параметр), а затем следует элементарное условие. Если значение параметра «sozdanie», то сохраняем в переменную текст «Создание landing page» и выводим в нужное место таким образом:

Если не одно из условий не сработало, то выводим значение по умолчанию:

Else{ $multiTitle = «Блог о создании landing page»; }

Для того, чтобы вам проще было разобраться, я подготовил исходник, в котором ссылки задал с utm меткой. Так вы легко сможете посмотреть, как это работает.

Вот такая статейка вышла. Спасибо вам за идею. Я думал, что самому сделать мультилендинг очень сложно и все никак не решался разобраться в этой теме.

Некоторые ребята, предлагали даже делать кучу разных страниц с разным контентом и давать разную ссылку в зависимости от запроса. Но это уж слишком муторно. Поэтому вот вам исходник. Пользуйтесь:) кроме того, можно менять не только текст, но и картинки, и другой тип контента. А на сегодня — все! Буду благодарен за ретвит. Всем пока!

платформа для интеграции ДНК с несколькими посадочными площадками для инженерии клеток млекопитающих | Исследование нуклеиновых кислот

Журнальная статья

Леонид Гайдуков,

Леонид Гайдуков

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Лилиана Вроблевска,

Лилиана Вроблевска

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Брайан Тиг,

Брайан Тиг

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Том Нельсон,

Том Нельсон

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Синь Чжан,

Синь Чжан

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Ян Лю,

Ян Лю

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Калпана Джагтап,

Калпана Джагтап

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Селамавит Мамо,

Селамавит Мамо

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Вен Аллен Ценг,

Вен Аллен Ценг

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Алексис Лоу,

Алексис Лоу

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

. .. Показать больше

Джишну Дас,

Джишну Дас

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Калпание Бандара,

Калпани Бандара

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Света Байджурадж,

Света Байджурадж

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Невин М Саммерс,

Невин М Саммерс

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Тимоти К. Лу,

Тимоти К. Лу

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Линь Чжан,

Линь Чжан

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Рон Вайс

Рон Вайс

Ищите другие работы этого автора на:

Оксфордский академический

пабмед

Google ученый

Примечания автора

Nucleic Acids Research , Volume 46, Issue 8, 4 May 2018, Pages 4072–4086, https://doi.org/10.1093/nar/gky216

Опубликовано:

10003 0

История статьи

Получено:

08 января 2018 г.

Получена редакция:

11 марта 2018 г.

Принято:

14 марта 2018 г.

Опубликовано:

02 апреля 2018 г.

Фильтр поиска панели навигации Исследование нуклеиновых кислотЭтот выпускРекомбинацияЦелевая модификация геновЖурналы NARНаука и математикаКнигиЖурналыOxford Academic Термин поиска мобильного микросайта

Закрыть

Фильтр поиска панели навигации Исследование нуклеиновых кислотЭтот выпускРекомбинацияЦелевая модификация геновЖурналы NARНаука и математикаКнигиЖурналыOxford Academic Термин поиска на микросайте

Advanced Search

Abstract

Создание клеточных линий млекопитающих, стабильно экспрессирующих многие трансгены, требует точной вставки больших количеств гетерологичной ДНК в хорошо охарактеризованные геномные локусы, но современные методы ограничены. Чтобы облегчить надежную крупномасштабную инженерию клеток CHO, мы определили 21 новый геномный сайт, который поддерживал стабильную долгосрочную экспрессию трансгенов, а затем сконструировали клеточные линии, содержащие один, два или три сайта рекомбинации «посадочных площадок» в выбранных локусах. Используя высокоэффективную рекомбиназу BxB1 вместе с различными маркерами селекции в каждом сайте, мы направили опосредованную рекомбиназой вставку гетерологичной ДНК в выбранные сайты, включая нацеливание на все три с помощью одной трансфекции. Мы использовали этот метод для контролируемой интеграции до девяти копий моноклонального антитела, представляющих около 100 т.п.н. гетерологичной ДНК в 21 единице транскрипции. Поскольку интеграция была нацелена на предварительно проверенные локусы, экспрессия рекомбинантного белка оставалась стабильной в течение нескольких недель, а дополнительные копии кассеты антител в интегрированной полезной нагрузке приводили к линейному увеличению экспрессии антител. В целом, эта многокопийная сайт-специфическая интеграционная платформа позволяет осуществлять контролируемую и воспроизводимую вставку больших количеств ДНК в стабильные геномные сайты, что имеет широкое применение в синтетической биологии млекопитающих, производстве рекомбинантных белков и биопроизводстве.

ВВЕДЕНИЕ

Клеточные линии млекопитающих, поддерживающие надежную и предсказуемую экспрессию большого количества трансгенов, представляют собой перспективную технологию для широкого спектра научных, промышленных и терапевтических применений. В контексте биопроизводства такие клеточные линии можно использовать для улучшения производства рекомбинантных белков, которые могут лечить аутоиммунные расстройства, рак и другие заболевания (1,2). Также растет интерес к дополнению клеточных линий совершенно новыми синтетическими генными сетями, которые могут резко изменить фенотип и поведение клеток (3). Эти методы могут когда-нибудь стать основой для «умной» клеточной терапии, которая может обнаруживать биомаркеры заболевания и реагировать соответствующим образом, леча или излечивая в настоящее время трудноизлечимые заболевания (4).

Такая крупномасштабная инженерия генома клетки требует способности точно и эффективно интегрировать большие количества гетерологичной ДНК в геномные локусы, которые поддерживают надежную экспрессию трансгенов, но современные подходы к инженерии генома не подходят для этой цели. Один класс методов включает случайную интеграцию: например, гетерологичная ДНК может быть упакована в ретровирус, который полуслучайно вставляет полезную нагрузку ДНК в геном (5–9). Поскольку каждую клетку могут инфицировать несколько ретровирусных частиц, трансдукция культуры большим количеством вирусов может привести к множественной интеграции и очень высокому уровню экспрессии трансгена. Однако обычно используемые ретровирусные векторы могут упаковывать только небольшое количество ДНК, а трансдуцированные популяции очень гетерогенны, что требует значительной работы по выделению стабильной клональной популяции.

Альтернативный подход предполагает интеграцию полезной нагрузки ДНК с использованием собственного механизма восстановления ДНК клетки. Путем фланкирования линейного трансгена ДНК, гомологичной желаемому сайту геномной вставки, трансфицированные клетки могут вставлять трансген в сайт-мишень посредством гомологичной рекомбинации с низкой частотой (10). Эффективность этого процесса рекомбинации можно повысить, используя нуклеазы с цинковыми пальцами, эффекторные нуклеазы TALE и системы CRISPR/Cas для индукции двухцепочечных разрывов в определенных местах (11,12). Однако частота гомологичной рекомбинации снижается по мере увеличения размера вставленной кассеты (13), ограничивая количество гетерологичной ДНК, которое может быть вставлено за одну интеграцию.

Третий класс методов использует сайт-специфические рекомбиназы для встраивания ДНК в геномы клеток млекопитающих. Сначала в геном интегрируется «посадочная площадка» (LP), содержащая сайт рекомбинации и селектируемый маркер. Затем используется соответствующая рекомбиназа для встраивания полезной нагрузки ДНК именно в этот локус, что обеспечивает воспроизводимую интеграцию в четко определенные участки генома (14–16). К сожалению, было описано лишь ограниченное количество хорошо проверенных сайтов «безопасной гавани», а современные подходы позволяют интегрировать только одну кассету. Клеточные линии, содержащие несколько хорошо охарактеризованных сайтов интеграции, могут обеспечить интеграцию разных трансгенов в разные сайты или воспроизводимую множественную интеграцию одной кассеты и, соответственно, более высокие уровни экспрессии трансгена. Такие клеточные линии могут служить легко настраиваемым «шасси», упрощающим крупномасштабную инженерию генома для фундаментальных исследований и биотехнологических приложений (17–23).

Здесь мы описываем интеграцию нескольких хорошо охарактеризованных сайтов LP в геном клеточной линии CHO-K1, которая приобрела популярность для производства рекомбинантных белковых терапевтических средств благодаря своему человеческому типу посттрансляционной модификации и его превосходный профиль безопасности и соответствия нормативным требованиям (24). Во-первых, мы использовали скрининг интеграции лентивирусов для идентификации 21 стабильного локуса интеграции и обнаружили, что большинство поддерживает долгосрочную стабильную экспрессию генов в отсутствие селективного давления. Затем мы вставили LP в выбранные локусы, используя CRISPR/Cas9.подход к редактированию генома и продемонстрировали, что они сохраняют желаемую стабильность экспрессии генов. Наконец, мы создали клеточные линии, несущие две и три LP, и продемонстрировали интеграцию до трех LP-сайтов за одну трансфекцию. Затем мы продемонстрировали их полезность, используя LP с различными флуоресцентными репортерами и маркерами селекции антибиотиков для целевой интеграции полезной нагрузки в выбранные сайты LP из клеточной линии с несколькими LP. Комбинируя мульти-LP клеточную линию с экспрессионными кассетами, несущими несколько копий моноклонального антитела, мы продемонстрировали точный контроль над уровнями экспрессии белка посредством контролируемой интеграции от одной до девяти копий трансгена. Важно отметить, что поскольку эти LP расположены в предварительно проверенных стабильных геномных сайтах, уровни экспрессии рекомбинантных белков оставались стабильными в течение нескольких недель непрерывного культивирования без селективного давления, а уровни рекомбинантных белков увеличивались линейно с увеличением числа копий гена. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что клеточные линии, несущие LP в нескольких хорошо охарактеризованных сайтах, обеспечивают точную, воспроизводимую инженерию генома CHO-K1 и обеспечивают предсказуемую экспрессию гетерологичных трансгенов из этих сайтов, что может иметь множество применений у млекопитающих. синтетическая биология, инженерия клеточных линий и биопроизводство.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Конструирование вектора

Вектор интеграции лентивирусной LP (pLV-LP) был сконструирован с использованием клонирования Gateway, как описано ранее (15), со следующими модификациями: от Дэвида Балтимора) (25) остов и кассета Gateway (гены устойчивости к хлорамфениколу и гены ccdB, окруженные сайтами рекомбинации attR4 и attR2). Реакцию LR с несколькими сайтами проводили между целевым вектором, вектором входа, несущим промотор фактора элонгации человека 1 альфа (hEF1a), за которым следовал сайт BxB1-attP и фланкированный сайтами рекомбинации attL4 и attR1, и вектором входа, кодирующим EYFP- Кассета P2A-гигромицина и окружена сайтами рекомбинации attL1 и attL2. В результате был получен вектор экспрессии pLV-hEF1a-BxB1-attP-EYFP-P2A-гигромицин. Вектор дополнительно содержал 5′- и 3′-LTR, необходимые для процессинга и интеграции лентивируса, и элемент WPRE (посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита Вудчак (WHP)) для повышения стабильности транскрипта вирусной мРНК (рис. 1А).

Векторы-доноры LP для интеграции CRISPR-Cas9 были сконструированы путем добавления последовательностей гомологических плеч (обычно длиной ~0,5–1 т.п.н.; дополнительная таблица S5) к кассете экспрессии LP, не содержащей лентивирусных элементов. Плечи гомологии были синтезированы в виде единого gBlock (Integrated DNA Technologies), содержащего сайт рестрикции PmeI между левым (LHA) и правым (RHA) плечами гомологии, а также сайты расщепления BsaI на 5′- и 3′-концах для клонирования Golden Gate (26) . Каждый gBlock был клонирован в вектор pIDTsmart (Integrated DNA Technologies), модифицированный таким образом, чтобы он содержал совместимые сайты клонирования BsaI. Кассета hEF1a-BxB1-attP-EYFP-P2A-Hygro LP была амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) из лентивирусного вектора pLV-LP и клонирована в линеаризованную основу PmeI pIDTsmart между левым и правым гомологическими плечами с использованием клонирования In-Fusion ( Clontech) для создания вектора донора LP1. Донорный вектор LP2, содержащий кассету hEF1a-BxB1-attP-EBFP-P2A-Blasticidin, был создан из LP1 с использованием клонирования In-Fusion.

Генетические конструкции, кодирующие легкие и тяжелые цепи (LC и HC, соответственно) человеческого моноклонального антитела (mAb) JUG444 (Pfizer), были сконструированы с использованием модульной сборки Gateway/Gibson (27). Промоторные последовательности hEF1a и цитомегаловируса (CMV) были клонированы в вектор входа Gateway между сайтами attL4 и attR1 с использованием клонирования In-Fusion, а гены легкой и тяжелой цепи JUG444 были клонированы в pDONR221 с использованием клонирования Gateway BP (Life Technologies). Реакции Gateway LR проводили между векторами промотора и входа гена и pZDonor_Seq( n )-GTW-Seq( n+1 )_R4_R2 векторы назначения для создания векторов экспрессии (единиц транскрипции в различных векторах положения). Реакции Гибсона проводили с использованием набора Gibson Assembly Ultra Kit (SGI-DNA) с использованием эквимолярных концентраций (~40 фмоль на 10 мкл реакции) очищенных на колонке экспрессионных векторов, адапторного вектора и вектора-носителя, расщепленных I-SceI, XbaI и XhoI, и ФсеИ соответственно. Полезная нагрузка 3x-hEF1a-mAb была сконструирована из вектора 2x-hEF1a-mAb с использованием иерархической сборки (27). Реакции Гибсона трансформировали в электрокомпетентные клетки E. cloni 10G (Lucigen) и выращивали при 30°C в среде LB с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и канамицина (50 мкг/мл). После проверки с помощью анализа рестрикционного картирования и секвенирования правильно собранные конструкции размножали в клетках Stbl3 (Invitrogen).

Лентивирусная инфекция

Вектор pLV-LP упаковывали в лентивирусные частицы в клетках HEK293FT и использовали для инфицирования прикрепленных клеток CHO-K1, как описано ранее (15). Стремясь к одному событию интеграции на клетку, мы использовали низкую множественность заражения (MOI) 0,05 и 0,005 в двух отдельных раундах заражения. За инфекцией следовала флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) пулов клеток, экспрессирующих EYFP, выделение клеток и размножение в течение 1–2 недель для размножения и обогащения стабильно экспрессирующими клетками. Последующая FACS была проведена для отбора отдельных клонов из верхних ~ 10 и ~ 15% клеток, экспрессирующих EYFP, из двух раундов заражения соответственно. Клоны размножали и анализировали с помощью проточной цитометрии и капельной цифровой ПЦР (ddPCR). Клеточные линии с надежной и гомогенной экспрессией EYFP из одной копии генов EYFP и гигромицина оценивали с помощью анализа геномного обхода и тестировали на их способность экспрессировать mAb (интеграция полезной нагрузки JUG-444 и анализ титра). У одного из первых идентифицированных клонов, mLP1, оказалось два события интеграции, и он также был включен в дальнейший анализ.

Идентификация сайтов интеграции лентивирусов путем обхода генома

Сайты интеграции лентивирусов были идентифицированы путем обхода генома с использованием набора для анализа сайтов интеграции Lenti-X™ (Clontech) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, геномную ДНК выделяли из 5 × 10 ⁶ клеток, расщепляли эндонуклеазами рестрикции (2 часа, 37°C) и очищали на колонке. Для каждой клеточной линии проводили четыре отдельные реакции: DraI, SspI, HpaI и положительный контроль, который включал геномную ДНК человека, расщепленную DraI. Адаптеры GenomeWalker лигировали с продуктами рестрикционного расщепления с тупыми концами путем инкубации 1,9мкл адаптеров 25 мкМ, 0,8 мкл 10-кратного буфера для лигирования и 0,5 мкл ДНК-лигазы Т4 (6 единиц/мкл) при 16°С в течение ночи. Реакции останавливали добавлением 32 мкл ТЭ (рН 7,5) и инкубацией при 70°С в течение 5 мин. Было проведено два раунда вложенной ПЦР с подавлением тачдауна, чтобы максимизировать специфичность амплификации интегрированных лентивирусных последовательностей. Продукты ПЦР разделяли на агарозном геле и основные полосы вырезали, очищали и секвенировали с использованием праймеров для ПЦР. Полученные данные о последовательности ДНК анализировали для определения сайта вставки лентивируса. Часть последовательности, составляющую фланкирующую геномную последовательность, исследовали в геноме клеток яичника китайского хомяка (CHO) с использованием BLAST (28), из которого определяли локусы интеграции.

Идентификация локуса Rosa26 в CHO-K1

Мышиный локус Rosa26 был описан как «безопасная гавань» для гетерологичной экспрессии генов и широко используется для генной инженерии в клетках мышей и человека (29,30). Чтобы идентифицировать предполагаемый сайт Rosa26 в CHO, мы провели поиск BLAST в геноме CHO-K1 с мышиным локусом Rosa26 (NC_000072, Mus musculus , штамм C57BL/6J, хромосома 6, GRCm38.p2). Мы идентифицировали гомологичный локус ~ 9 т.п.н. (идентичность последовательности нуклеотидов ~63%) в каркасе 2241 CHO-K1, расположенном ниже по течению от гена Thumpd3 в обратной ориентации. В CHO-K1 этот локус является частью большой (> 2 Мб) неаннотированной области. CRISPR-Cas9был использован для целевой интеграции LP в локус Rosa26 на 8 т.п.о. ниже последнего экзона (экзон 10) гена Thumpd3 в обратной ориентации, что привело к моно- и биаллельным клонам LP Rosa26, названным sLP20 и biLP20, соответственно.

Биоинформатический анализ локусов интеграции

Обогащение вновь идентифицированных локусов интеграции в различных путях KEGG (31) было рассчитано с использованием инструментария WebGestalt (32). Значимость чрезмерного представительства оценивали с помощью гипергеометрического теста. Уровни экспрессии мРНК сравнивали в трех группах — сайты интеграции, соответствующие кодирующим генам, генам «домашнего хозяйства» и другим генам (не «домашним хозяйствам») — с использованием опубликованных данных секвенирования РНК из CHO-K1 (33), а также недавно полученных данных (рукопись в процессе подготовки). ). Для анализа секвенирования РНК клонально размноженные клетки CHO-K1 со случайной интеграцией модельного моноклонального антитела JUG444 выращивали в биореакторах с периодической подпиткой, используя коммерчески доступные среды CD CHO (Thermo Fisher). Отбирали образцы клеточных культур и центрифугировали в клеточный осадок примерно 1 × 10 ⁶ жизнеспособных клеток и РНК, экстрагированной с использованием реагента Trizol (Thermo Fisher) и мгновенно замороженной в ванне с сухим льдом/этанолом. В общей сложности 200 нг общей РНК использовали для конструирования специфической для нитей библиотеки с использованием набора для подготовки образцов TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation Kit (Illumina). Полученную библиотеку вставок размером 160 п.н. количественно определяли с помощью количественной ПЦР, а размер вставки библиотеки измеряли с помощью биоанализатора Agilent 2100. Образцы секвенировали с использованием Illumina HiSeq 2000, а обработанные значения RPKM использовали для анализа. Для определения генов домашнего хозяйства использовали ранее созданный сборник (34). Значимость различий в уровнях экспрессии в трех разных группах оценивали с использованием U-критерия Манна-Уитни.

Создание посадочных площадок путем гомологичной рекомбинации с CRISPR/Cas9

Донорные векторные последовательности для гомологичной рекомбинации были получены из общедоступной базы данных генома CHO-K1 (35,36) на основе идентифицированных сайтов интеграции лентивирусов. Во-первых, направляющие последовательности РНК были разработаны с использованием алгоритма CasFinder/CasValue или инструмента проектирования CRISPR, такого как http://crispr.mit.edu/ (37), как правило, в пределах 1 кб от сайтов интеграции лентивирусов. Затем 0,5–1 т.п.н. геномных последовательностей 5′ и 3′ сайта-мишени гРНК использовали в качестве плеч гомологии, фланкирующих последовательность LP, для создания донорных векторов LP. Целевые интеграции выполняли путем котрансфекции кольцевого донорного вектора LP (100–500 нг) с помощью Cas9. и гРНК с использованием трех различных методов. Метод 1 включал клонирование последовательности гРНК в вектор px330-U6-chimeric_BB-CBh-hSPCas9 (плазмида Addgene 42230, подарок Feng Zhang) (38) с использованием сборки Golden Gate (26) с BbsI. Полученный вектор рх330-гРНК, совместно экспрессирующий гРНК и оптимизированный кодон человека Streptococcus pyogenes Cas9, котрансфицировали в диапазоне концентраций (обычно 10–50 нг) вместе с вектором донора LP. Метод 2 включал котрансфекцию 50–200 нг px330-hSPCas9.экспрессирующий вектор (плазмида Addgene 42230) (38) и 100–150 нг гРНК GeneArt DNA String (ThermoFisher). Метод 3 включал котрансфекцию 0,5 мкг мРНК Cas9 (Invitrogen) и 100–150 нг гРНК GeneArt DNA String (ThermoFisher). Из 10 Cas9-сконструированных LP 5, 3 и 2 клона были сконструированы по способу 1, 2 и 3 соответственно без заметных различий в эффективности и специфичности геномных модификаций. Около 10 ⁵ клеток трансфицировали в двух повторностях с использованием электропоратора Neon (Invitrogen) и высевали в 24-луночный планшет. Через три дня после трансфекции клетки переносили в 6-луночный планшет и подвергали селекции антибиотиков с использованием либо гигромицина (600 мкг/мл), либо бластицидина (10 мкг/мл) в течение 2 недель с последующей сортировкой клонов с помощью FACS. В качестве альтернативы клетки размножали и культивировали в течение 8–10 дней и непосредственно подвергали клональной FACS на основе экспрессии EYFP. Отдельные клоны были проверены с помощью ряда геномных тестов, включая диагностическую ПЦР, ddPCR и саузерн-блоттинг.

Культура клеток и трансфекции

Адгезивные клетки CHO-K1 (ATCC) поддерживали в полной среде HAMS-F12 (cHAMS-F12) (ATCC), содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich), 1 % HyClone заменителей аминокислоты (GE Healthcare Life Sciences) и 1% пенициллин/стрептомицин (Gibco). Клетки выращивали во влажном инкубаторе при 37°С с 5% СО ₂ и пассировали каждые 2–3 дня. Трансфекцию проводили с помощью системы электропорации Neon (Invitrogen) с использованием 10 мкл наконечников Neon и 1 × 10 ^{5 Клетки} трансфицировали в двух повторностях импульсами 1560 В/5 мс/10 и переносили в 24-луночный планшет, содержащий cHAMS-F12 без антибиотиков. Для целевой интеграции LP с помощью CRISPR/Cas9 клетки котрансфицировали кольцевым донорным вектором LP (100–500 нг) и либо px330-hSPCas9-гРНК (10–50 нг; плазмида Addgene 42230 с клонированной последовательностью гРНК), либо px330-hSPCas9 (50–200 нг; плазмида Addgene 42230) (38) и гРНК GeneArt DNA String (100–150 нг; ThermoFisher) или мРНК Cas9 (0,5 мкг; Invitrogen) и гРНК GeneArt DNA String (100–150 нг; Термофишер). Через три дня после трансфекции клетки переносили в 6-луночный планшет и среду заменяли на cHAMS-F12 с добавлением либо гигромицина (600 мкг/мл), либо бластицидина (10 мкг/мл) в зависимости от конфигурации LP. Клетки выдерживали в условиях селекции в течение 2 недель, обновляя среду, содержащую антибиотик, каждые 2–3 дня. Для интеграции mAb, экспрессирующих полезную нагрузку, 1 × 10 9Клетки 0339 5 трансфицировали в двух повторностях 500 нг экспрессирующей BxB1 плазмиды (pEXPR-CAG-BxB1) и 0,5–1 мкг вектора mAb при тех же параметрах, что и выше, и переносили в 24-луночный планшет, содержащий cHAMS-F12 без антибиотиков. Через три дня после трансфекции клетки переносили в 6-луночный планшет и среду заменяли на cHAMS-F12 с добавлением следующих комбинаций антибиотиков. Интегранты с одним LP отбирали только с пуромицином (8 мкг/мл), а интегранты с несколькими LP отбирали с пуромицином (8 мкг/мл или 20 мкг/мл для полезной нагрузки mAb, интегрированных в один или несколько LP, соответственно) или пуромицином. и гигромицин или пуромицин и бластицидин для выбора клеточных пулов с полезной нагрузкой mAb, интегрированной в разные LP. Через 2 недели отбора правильная интеграция была подтверждена полным исчезновением флуоресценции LP (либо EYFP, либо EBFP, либо обоих). Клетки поддерживали либо в виде пула интегрантов mAb, либо сортировали в клональные популяции с помощью FACS. Жизнеспособность и плотность клеток контролировали с помощью автоматического анализатора жизнеспособности клеток Vi-CELL (Beckman-Coulter).

Проточная цитометрия и клонирование отдельных клеток

Флуоресценцию клеток анализировали с использованием проточного цитометра LSRFortessa (BD Biosciences), оснащенного лазерами с длиной волны 405, 488 и 561 нм. Всего для анализа было собрано 30 000 событий с использованием лазера 488 нм и полосового фильтра 530/30 нм для EYFP и лазера 405 нм и фильтра 450/50 для EBFP. Калибровочные частицы SPHERO RCP-30-5A Rainbow, восемь пиков (Spherotech) использовали для нормализации флуоресценции и преобразования измеренных интенсивностей флуоресценции в абсолютные единицы флуоресценции (MEFL, молекулярные эквиваленты флуоросцеина). Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения FACSDiva (BD Biosciences) и FlowJo (FlowJo LLC). Сортировку клеток проводили на клеточном сортере FACSAria. Нетрансфицированные клетки CHO-K1 использовали для установки морфологических ворот. После интеграции LP положительные по EYFP и EBFP клетки были отсортированы на 96-луночные планшеты. После интеграции полезной нагрузки mAb применялись различные схемы сортировки, включая сортировку одиночных положительных (EYFP+/EBFP- и EYFP-/EBFP+) и двойных отрицательных (EYFP-/EBFP-) клеток для выбора клонов с несколькими LP с полезной нагрузкой mAb, интегрированной в разные LP. В обоих случаях отдельные клетки сортировали в 96-луночные планшеты и размножали в 24-луночные, а затем в 6-луночные планшеты.

Исследования стабильности экспрессии генов посадочной площадки

Для исследований стабильности клетки LP выдерживали в 6-луночных планшетах в cHAMS-F12 в течение 1–3 месяцев без отбора антибиотиков (гигромицин или бластицидин). Клетки пассировали каждые 3–4 дня и еженедельно анализировали с помощью проточной цитометрии, по которой рассчитывали среднюю флуоресценцию (EYFP или EBFP) и процент положительных клеток. Нетрансфицированные клетки CHO-K1 использовали для установки морфологических ворот. Калибровочные частицы SPHERO RCP-30-5A Rainbow, восемь пиков (Spherotech) обычно использовались во время исследования стабильности для нормализации флуоресценции и расчета MEFL. Время удвоения, равное 18 ч, использовали для расчета числа поколений прилипших клонов, полученных из CHO-K1.

Генотипический анализ посадочных площадок и интегрантов mAb

Анализ копий гена проводили с помощью ddPCR с использованием системы QX100 (Bio-Rad Laboratories). Геномную ДНК расщепляли CviQ1 и разбавляли в 10 раз. Для каждого зонда количественно определяли два гена-мишени: EYFP и гигромицин или EBFP и бластицидин для клонов LP и LC и HC для интегрантов mAb. Количество копий гена нормализовали по эндогенному гену домашнего хозяйства CHO Cog1. Для каждого образца использовали два-три прогона.

Для диагностической ПЦР геномную ДНК выделяли с помощью набора для геномной ДНК QIAamp (Qiagen) и ПЦР амплифицировали с помощью ДНК-полимеразы PfuUltra II Fusion HS (Agilent). Для проверки LP внутренние праймеры LP, обращенные наружу, спаривались с внешними праймерами в фланкирующей геномной последовательности (целевые) или с праймерами в скелете вектора (нецелевые). Для интеграции полезной нагрузки mAb праймер, специфичный для полезной нагрузки, сочетали с праймером, специфичным для LP (целевой), или с праймером, специфичным для скелета вектора (нецелевой).

Для Саузерн-блоттинга геномную ДНК количественно определяли с помощью флуорометра Qubit и набора Qubit dsDNA BR (Invitrogen). Зонды были созданы с помощью ПЦР с использованием соответствующих наборов праймеров и помечены dCTP (α- ³² P) (Perkin Elmer) с использованием набора для мечения случайных праймеров Prime-It RmT (Stratagene) с последующим удалением свободных нуклеотидов с помощью Quick Spin. Колонки для очистки радиоактивно меченой ДНК Sephadex G-50 (Roche). Для клонов LP ДНК расщепляли BamHI, HindIII и EcoRV и использовали зонды для EYFP, EBFP, гигромицина и бластицидина, а для интегрантов mAb ДНК расщепляли SpeI и XbaI и использовали зонды для LC и HC.

Экспрессия антител из стабильно интегрированных посадочных площадок

Векторы полезной нагрузки mAb, экспрессирующие человеческое моноклональное антитело JUG444 (Pfizer), интегрировали в клеточные линии LP, отобранные в течение двух недель с пуромицином (8 мкг/мл или 20 мкг/мл для интегрированной полезной нагрузки mAb в одну или несколько LP соответственно) и сохранялись либо в виде клеточных пулов, либо в виде клональных популяций после FACS. Для анализа стабильности экспрессии mAb 6-луночный эталонный планшет с клетками непрерывно размножали в cHAMS-F12 и еженедельно использовали для посева клеток для анализа экспрессии mAb. 1,5 × 10 9Клетки 0339 5 высевали в 2–3 повторностях в 24-луночный планшет с 0,5 мл среды cHAMS-F12 и выращивали при 37°С. На 4-й день собирали кондиционированные среды и измеряли количество секретируемого JUG444 в двух повторностях с помощью системы Octet RED96 с использованием биосенсоров захвата Fc IgG человека (AHC) или протеина А (ForteBio). датчики. Очищенный JUG444 использовали для построения стандартной кривой, по которой получали титры mAb.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обнаружение стабильных сайтов интеграции посадочных площадок в геноме CHO-K1

Чтобы обнаружить стабильные сайты интеграции в геноме CHO-K1, мы использовали случайный лентивирусный скрининг с полезной нагрузкой LP. Интеграция лентивирусов была выбрана для скрининга локусов, потому что она эффективно отбирает активно транскрибируемые геномные сайты (6–9) и обеспечивает грубые средства для контроля количества копий с помощью MOI. Кассета LP содержала конститутивный промотор, управляющий совместной экспрессией флуоресцентного репортера (EYFP) и маркера селекции (гигромицин), а также сайт присоединения фага attP для рекомбиназы BxB1 (15) (рис. 1А). Использование LP с флуоресцентным репортером в качестве лентивирусной полезной нагрузки позволило нам отслеживать начальную инфекцию и выбирать стабильные интегранты с последовательной долгосрочной экспрессией, а затем использовать BxB1-опосредованную рекомбинацию ДНК для специфичной для сайта вставки дополнительных генов в локус интеграции.

Рисунок 1.

Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

Двадцать стабильных сайтов интеграции были обнаружены в CHO-K1 с помощью лентивирусного скрининга с LP-зондом. ( A ) Схематическая диаграмма вектора интеграции лентивирусных LP (pLV-LP), используемого для  лентивирусного скрининга. Ключевые компоненты включают 5′- и 3’LTR, необходимые для процессинга и интеграции лентивируса, сайт присоединения attP для рекомбиназы BxB1, конститутивный промотор hEF1a, управляющий экспрессией репортера EYFP, и маркер селекции гигромицина (Hygro), которые совместно экспрессируются с использованием Пептид пропуска трансляции 2A и элемент WPRE (посттранскрипционный регуляторный элемент WHP) для повышения стабильности транскрипта вирусной мРНК. ( B ) Лентивирусная инфекция и отбор клонов-кандидатов LP. Лентивирусные частицы упаковывали с вектором LP и использовали для заражения прикрепившихся клеток CHO-K1 при низкой множественности заражения (0,05 и 0,005). Клоны, экспрессирующие EYFP, собирали с помощью FACS (верхние ~10 и ~15% клеток, экспрессирующих EYFP), размножали и анализировали с помощью проточной цитометрии. Клоны с гомогенными профилями флуоресценции выделяли и подвергали дальнейшему анализу. ( C ) Анализ копий гена ddPCR клонов LP. Вертикальная ось обозначает количество копий гена EYFP, нормализованное по отношению к гену домашнего хозяйства Cog1. Клоны-кандидаты, выделенные из лентивирусного скрининга, оценивали с помощью анализа ddPCR для отбора моноклональных LP с одиночной интеграцией (названных от mLP2 до mLP19).). Обратите внимание, что mLP1 представляет собой клон с двойной интеграцией, а клон F1 с номером копии гена 1 был исключен из-за нестабильности генома. ( D ) Анализ стабильности экспрессии EYFP 18 лентивирусных моноклональных LP с одинарной интеграцией. Клетки размножали в течение 2 месяцев при отсутствии селекции антибиотиков. Генетическая стабильность оценивалась еженедельно путем мониторинга экспрессии EYFP с помощью проточной цитометрии, из которой были получены средняя интенсивность флуоресценции EYFP (верхняя панель) и процент EYFP-позитивных клеток (нижняя панель). Пятнадцать клонов показали >96% EYFP-положительных клеток после 2 месяцев анализа стабильности, в то время как три клона продемонстрировали умеренную стабильность (примерно 75–90% положительных клеток; подробности см. на дополнительном рисунке S3A-B и в таблице S1). ( E ) Анализ стабильности экспрессии антител с помощью пулов клонов mLP, интегрированных с цепью 1x-hEF1a-mAb. Цепь mAb интегрировали с рекомбиназой BxB1, а пулы интегрантов LP-mAb отбирали с помощью пуромицина. Титры mAb анализировали еженедельно в кондиционированных средах из пулов поликлональных клеток, размноженных без селекции. Каждая точка данных представляет одну неделю размножения клеток и измерения среднего титра с биологическими дубликатами или тройками (9).0213 n = 2 или 3). Время удвоения, равное 18 часам, использовали для расчета числа поколений прикрепленных клонов, полученных из CHO-K1. Те же символы используются на панелях D и E (подробности см. Дополнительный рисунок S4B и таблицу S1).

Вектор LP был упакован в лентивирусные частицы и использован для инфицирования прикрепленных клеток CHO-K1 при низкой множественности заражения (0,05 и 0,005) с целью получения одного события интеграции на клетку. За инфекцией следовала селекция гигромицином и FACS пулов клеток, экспрессирующих EYFP. Затем пулы экспрессирующих клеток размножали в течение примерно 2 недель без селекции гигромицином, чтобы отобрать стабильно экспрессирующие клетки, которые сохраняют устойчивую экспрессию LP в отсутствие селекции антибиотиками. Стабильные клеточные пулы затем были повторно отсортированы в клональные популяции клеток с наивысшей экспрессией EYFP с использованием двух порогов экспрессии: ~ 3% лучших клонов и ~ 10–15% лучших клонов из двух раундов заражения (рис. 1B). Отсортированные клоны были размножены и проанализированы на экспрессию EYFP и количество копий гена, чтобы выбрать стабильные клоны с одним событием интеграции и сильным однородным профилем экспрессии EYFP (рис. 1B и C). Мы стремились обнаружить стабильные клоны с одиночной интеграцией с сильной и последовательной экспрессией. Оказалось, что большинство клонов с высокой экспрессией (около 3% лучших экспрессирующих) имеют множественные интеграции и были отброшены. В группе, отобранной от ~10 до 15% лучших экспрессоров, клоны, полученные с использованием более высокого MOI (0,05), содержали ~50% одиночных интегрантов, в то время как инфекции с более низким MOI (0,005) давали только одиночные интегранты. Всего из лентивирусных скринингов было выделено 18 моноклональных клонов с одиночной интеграцией (названных от mLP2 до mLP19).; Рисунок 1С). Клон с двойной интеграцией, mLP1, также был выделен для дальнейшего анализа (рис. 1C). Отобранные клоны были дополнительно проанализированы Саузерн-блоттингом, что подтвердило результаты копирования гена ddPCR (дополнительная фигура S1).

Помимо случайного скрининга лентивирусов, мы также провели поиск в геноме CHO-K1 областей, гомологичных локусу Rosa26, который широко используется для генной инженерии в клеточных линиях мышей и человека (29,30). Мы провели BLAST-поиск мышиного локуса Rosa26 (29) против каркаса генома CHO-K1 и идентифицировали гомологичную область ~ 9 т.п.н. в CHO-K1 (63% идентичности последовательности) (дополнительная фигура S2). Подобно мышиному локусу Rosa26, гомологичная область в CHO-K1 расположена ниже гена Thumpd3 в обратной ориентации. В CHO-K1 этот локус является частью большой (> 2 Мб) неаннотированной области. Мы использовали CRISPR-Cas9 для интеграции LP на 8 т.п.н. ниже последнего экзона гена Thumpd3 в обратной ориентации и, таким образом, получили клоны, содержащие одну копию (моноаллельную) и двойную копию (биаллельную) LP Rosa26. которые мы назвали sLP20 и biLP20 соответственно (рис. 2B и C; обсуждается ниже).

Рисунок 2.

Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

Линии клеток LP, реконструированные с помощью CRISPR/Cas9, сохраняют генетическую стабильность и стабильную экспрессию полезной нагрузки. ( A ) Схематическая диаграмма донорного вектора LP, используемого для целенаправленной вставки CRISPR/Cas9 в недавно обнаруженные стабильные сайты интеграции клеток WT CHO-K1. Кассета LP аналогична вектору интеграции лентивирусных LP (pLV-LP, рис. 1A), но включает локус-специфические левое и правое гомологические плечи (LHA и RHA) вместо лентивирусных LTR и сигнальную последовательность полиА вместо WPRE. . Клоны LP с одинарной интеграцией (sLP) были сконструированы путем целенаправленной вставки зонда LP в геномные локусы, идентифицированные в соответствующих лентивирусных клонах mLP. ( B ) Анализ копий гена ddPCR выбранных клонов LP, сконструированных с помощью CRISPR/Cas9. sLP1-1 и sLP1-2 представляют собой линии с одиночной интеграцией, несущие кассету LP в локусах, полученных из клона mLP1 с двойной интеграцией. sLP2, sLP3, sLP6 и sLP8 являются реконструированными гомологами лентивирусных клонов mLP. sLP20 и biLP20 являются моноаллельными и биаллельными интегрантами в недавно идентифицированном локусе Rosa26. Вертикальная ось обозначает количество копий гена EYFP, нормализованное по отношению к гену домашнего хозяйства Cog1. ( С ) Саузерн-блот-анализ клонов sLP20 и biLP20. гДНК расщепляли рестрикционными ферментами BamHI (5′) или HindIII (3′) и гибридизовали с зондом, меченным радиоактивным изотопом антигигромицина. Были проанализированы два клона sLP20 и два клона biLP20 (В2, В12 и В7, В11 соответственно). ( D ) Анализ стабильности экспрессии EYFP. Клетки размножали в течение 2 месяцев при отсутствии отбора антибиотиков. Генетическая стабильность оценивалась еженедельно путем мониторинга интенсивности флуоресценции EYFP (верхняя панель) и процента EYFP-положительных клеток (нижняя панель) с помощью проточной цитометрии. Все клоны показали >99% EYFP-позитивных клеток после 2 месяцев анализа стабильности. ( E ) Анализ стабильности экспрессии антител. Клеточные пулы интегрантов LP-mAb, стабильно экспрессирующих цепь 1x-hEF1a-mAb, размножали в отсутствие селекции, и еженедельно измеряли уровни mAb в кондиционированных средах. Каждая точка данных представляет 1 неделю размножения клеток и средние измерения mAb с биологическими дубликатами или тройками ( n = 2 или 3). Время удвоения, равное 18 часам, использовали для расчета числа поколений прикрепленных клонов, полученных из CHO-K1. Те же символы используются на панелях D и E.

Для оценки стабильности экспрессии генов из вновь открытых локусов мы размножали 18 моноклональных лентивирусных МЛП с одиночной интеграцией в течение 1,5–2 месяцев (65–75 поколений) в отсутствие селекции антибиотиков (гигромицин) и еженедельно измеряли их экспрессию EYFP. с помощью проточной цитометрии. Большинство клонов демонстрировали очень стабильную экспрессию EYFP (как правило, 96–100% положительных клеток и отсутствие падения уровней экспрессии в течение 2 месяцев исследования стабильности), в то время как три клона демонстрировали стабильные средние уровни экспрессии EYFP, но умеренное снижение процента экспрессирующих EYFP клеток. клеток (∼75–90% положительных клеток через 2 месяца анализа стабильности; Рисунок 1D; подробности см. на дополнительном рисунке S3A-B и в таблице S1). Саузерн-блот-анализ выбранных клонов из ранних и поздних пассажей (поколение 9 и 65 соответственно) также подтвердил геномную стабильность LP в течение как минимум 2 месяцев размножения клеток без селекции (дополнительная фигура S1).

Интересно, что, несмотря на то, что все LP были расположены в разных геномных контекстах, уровни EYFP между клонами LP практически не различались, при этом большинство LP демонстрировали одинаковые уровни флуоресценции и стабильность (рис. 1D; дополнительный рисунок S3A-B и таблица). С1). Сходные уровни экспрессии могут быть результатом того факта, что транскрипция с нашего LP управляется одним и тем же конститутивным промотором, а локальное геномное окружение оказывает лишь незначительное влияние. Мы также не наблюдали заметной разницы в скорости роста или морфологии клонов LP по сравнению с клетками CHO-K1 дикого типа.

Для оценки экспрессии рекомбинантных белков из лентивирусных LP мы использовали BxB1-опосредованную рекомбинацию для интеграции ДНК-вектора, кодирующего одну копию тяжелой и легкой цепи человеческого моноклонального антитела (mAb) JUG444 (1x-hEF1a-mAb вектор ; Дополнительная фигура S4A) в выбранные клоны LP. На сайт-специфическую интеграцию указывало усиление устойчивости к пуромицину, кодируемому полезной нагрузкой, и исчезновение экспрессии EYFP, кодируемой LP. Затем клеточные пулы интегрантов ДНК размножали в течение 5 недель в отсутствие селекции и еженедельно анализировали на экспрессию mAb. Большинство mLP, включая три клона с умеренной стабильностью EYFP, демонстрировали стабильную экспрессию mAb без падения титров в течение более месяца (рис. 1E; подробности см. в дополнительной фигуре S4B и таблице S1). В соответствии с низкой вариабельностью уровней EYFP аналогичные уровни титров mAb также наблюдались среди различных mLP. Мы наблюдали слабую корреляцию между уровнями EYFP и титрами mAb клонов mLP (дополнительная фигура S5A) либо из-за разных механизмов экспрессии EYFP и mAb (т. е. внутриклеточной экспрессии EYFP и секретируемой экспрессии mAb), либо из-за отсутствия вариаций. в экспрессии EYFP и mAb между LP. В целом, мы пришли к выводу, что недавно обнаруженные локусы обеспечивают эффективную сайт-специфическую интеграцию полезной нагрузки ДНК и поддерживают стабильную долгосрочную экспрессию трансгенов (включая секретируемые рекомбинантные белки).

Идентификация стабильных локусов геномной интеграции LP

Мы использовали анализ геномного обхода для идентификации сайтов интеграции лентивирусов в стабильных клеточных линиях LP. Геномные последовательности, фланкирующие сайты интеграции лентивирусов, были исследованы в базе данных генома CHO-K1, чтобы идентифицировать локусы интеграции для 18 mLP с одинарной интеграцией, клона mLP1 с двойной интеграцией и недавно идентифицированного LP Rosa (LP20) (таблица 1; дополнительные таблицы). С2 и 3). Мы определили 21 уникальную интеграционную площадку, из них 9сайты, расположенные в неаннотированных или некодирующих областях, и 12 сайтов, расположенных в аннотированных областях, которые могут быть картированы с генами (11/12 находятся в интронах). Гены принадлежат к различным функциональным семействам, и ранее о них не сообщалось как о стабильных сайтах интеграции в клетках млекопитающих.

Локусы интеграции посадочной площадки в геноме CHO-K1

Таблица 1.

Локусы интеграции посадочной площадки в геноме CHO-K1

2 4142 поз. 0481

^{посттрансляционные модификации тРНК0481}

LP клон .	Locus (подмости, позиция) .	Джин .	Относительная ориентация (по отношению к каркасу генома, ориентиру гена) .	Интрон/экзон .	Функция гена .
sLP1-1 a	scaf 1924	unannotated region	reverse	non-coding
	pos 60148
sLP1-2 a	scaf 1361	unannotated region	reverse	non-coding
	pos 1075377
mLP2	scaf 1558	область без аннотаций	реверс	не кодирование
mLP3	scaf 5035	unannotated region	forward	non-coding
	pos 1864526
mLP4 (A5)	scaf 934	Bmp5	прямой, обратный	интрон 1	путь TGF-β
	pos 837184
mLP5 (A8)	scaf 2625 pos 237547	Ssbp2	reverse, forward	intron 9	genome stability, tumor suppression, cell growth
mLP6 (B5)	scaf 156 pos 5618538	Trmt6	обратный, обратный	интрон 8
mLP7 (C2)	scaf 424 pos 177811	unannotated region	reverse	non-coding
mLP8 (C5)	scaf 2259 pos 86304	Clcc1	forward, reverse	экзон 11	хлоридный канал во внутриклеточных компартментах
mLP9 (C10)	scaf 3405 pos 4675	Fam114a1 (Noxp48, 7 9 обратная)0481	intron 1	apoptosis, regulation of cell proliferation
mLP10 (D9)	scaf 1727 pos 865981	Lrba	reverse, reverse	intron 40	intracellular vesicle transport, secretion of immune effector molecules
mLP11 (E8)	каркас 1385 поз. 0478 mLP12 (G8)	scaf 1485 pos 438214	Dcn	reverse, forward	intron 2	cellular matrix proteoglycan, tumor suppression, TGF-β pathway
mLP13 (G11)	scaf 2165 pos 1	Cep128	reverse, forward	intron 23	centrosomes-associated cell division
mLP14 (PL1-2)	scaf 832 pos 117635	Aacs	reverse, reverse	intron 5	fatty acid-synthesis during adipose tissue development
mLP15 (PL1-3)	scaf 262 pos 1571782	Aldh5a1	forward, reverse	intron 4	breakdown of Нейротрансмиттер GABA
MLP16 (PL1-10)	SCAF 1796 POS 188123	SMAD6	ПЕРСОНТАРИЯ	IRTRON 2	ПЕРСОНТАРИЯ	IRTRON 2	ПЕРСОВРЕЦИИ	.0481
mLP17 (PL1-11)	scaf 624 pos 2206187	unannotated region	forward	non-coding
mLP18 (PL1-17)	scaf 1753 pos 117475	unannotated region	reverse	non-coding
mLP19 (PL1-20)	scaf 1149 pos 49532	Ptprq	reverse, forward	intron 8	cellular proliferation and differentiation
sLP20 b (Rosa-B12)	scaf 2241 pos 132202	Rosa26 locus (downstream to Thumpd3)	reverse, reverse	non-coding

. 0481 9

клон LP .	Locus (подмости, позиция) .	Джин .	Относительная ориентация (по отношению к каркасу генома, ориентиру гена) .	Интрон/экзон .	Функция гена .
sLP1-1 a	scaf 1924	unannotated region	reverse	non-coding
	pos 60148
sLP1-2 a	каркас 1361	неаннотированная область	reverse	non-coding
	pos 1075377
mLP2	scaf 1558	unannotated region	reverse	non-coding
	pos 414422
mLP3	scaf 5035	unannotated region	forward	non-coding
	pos 1864526
mLP4 (A5)	scaf 934	Bmp5	forward, reverse	intron 1	TGF-β Pathway
	POS 837184										Ssbp2	reverse, forward	intron 9	genome stability, tumor suppression, cell growth
mLP6 (B5)	scaf 156 pos 5618538	Trmt6	reverse, reverse	intron 8	посттрансляционная модификация тРНК
mLP7 (C2)	scaf 424 pos 177811	неаннотированная область	реверс	некодирующая 1 10481
mLP8 (C5)	scaf 2259 pos 86304	Clcc1	forward, reverse	exon 11	chloride channel in intracellular compartments
mLP9 (C10)	scaf 3405 pos 4675	Fam114a1 (Noxp20)	обратный, обратный	интрон 1	апоптоз, регуляция клеточной пролиферации
mLP10 (D9)	scaf 1727 pos 8	Lrba	reverse, reverse	intron 40	intracellular vesicle transport, secretion of immune effector molecules
mLP11 (E8)	scaf 1385 pos 898266	unannotated region	reverse	non-coding
mLP12 (G8)	scaf 1485 pos 438214	Dcn	прямой, обратный0481
mLP13 (G11)	scaf 2165 pos 1	Cep128	reverse, forward	intron 23	centrosomes-associated cell division
mLP14 (PL1-2)	scaf 832 pos 117635	Aacs	реверс, реверс	интрон 5	синтез жирных кислот при развитии жировой ткани
mLP15 (PL1-3)	scaf 262 8 pos 157040478 Aldh5a1	forward, reverse	intron 4	breakdown of the neurotransmitter GABA
mLP16 (PL1-10)	scaf 1796 pos 188123	Smad6	forward, forward	intron 2	transcriptional regulation сигнальных путей BMP и TGF-β
mLP17 (PL1-11)	scaf 624 pos 2206187	неаннотированная область	вперед	некодирующая0481
mLP18 (PL1-17)	scaf 1753 pos 117475	unannotated region	reverse	non-coding
mLP19 (PL1-20)	scaf 1149 pos 49532	Ptprq	reverse, forward	intron 8	cellular proliferation and differentiation
sLP20 b (Rosa-B12)	scaf 2241 pos 132202	Rosa26 locus (downstream to Thumpd3)	обратный, обратный	некодирующий

^a sLP1-1 и sLP1-2 представляют собой локусы, идентифицированные в клонах с двойной интеграцией с CPR9-CaRIS и сконструированные как одиночные интеграционные посадочные площадки.

^b sLP20 был идентифицирован путем поиска гомологии последовательностей генома CHO-K1 с последовательностью Rosa26 мыши и сконструирован с помощью CRISPR-Cas9.

Открыть в новой вкладке

Таблица 1.

Локусы интеграции посадочной площадки в геноме CHO-K1

80478  

1

10847

LP клон .	Locus (подмости, позиция) .	Джин .	Относительная ориентация (по отношению к каркасу генома, ориентиру гена) .	Интрон/экзон .	Функция гена .
sLP1-1 a	каркас 1924	unannotated region	reverse	non-coding
	pos 60148
sLP1-2 a	scaf 1361	unannotated region	reverse	non-coding
	pos 1075377
mLP2	scaf 1558	unannotated region	reverse	non-coding
	pos 414422
mLP3	scaf 5035	unannotated region	вперед	без кодирования
	поз. 1864526
mLP4 (A5)	scaf 934	Bmp5	forward, reverse	intron 1	TGF-β pathway
	pos 837184
mLP5 (A8)	scaf 2625 pos 237547	Ssbp2	обратный, прямой	интрон 9	стабильность генома, подавление опухоли, рост клеток
mLP6 (B5)	scaf 156 pos 5618538	Trmt6	reverse, reverse	intron 8	tRNAs post-translational modification
mLP7 (C2)	scaf 424 pos 177811	unannotated region	reverse	non-coding
mLP8 (C5)	scaf 2259 pos 86304	Clcc1	forward, reverse	exon 11	chloride channel in intracellular compartments
mLP9 (C10)	scaf 3405 pos 4675	Fam114a1 (Noxp20)	reverse, reverse	intron 1	apoptosis, regulation of cell proliferation
mLP10 ( D9)	scaf 1727 pos 865981	Lrba	реверс, реверс	интрон 40	внутриклеточный везикулярный транспорт, секреция иммунных эффекторных молекул
mLP11 (E8)	scaf 1385 pos 898266	unannotated region	reverse	non-coding
mLP12 (G8)	scaf 1485 pos 438214	Dcn	reverse, forward	интрон 2	протеогликан клеточного матрикса, подавление опухоли, путь TGF-β
mLP13 (G11)	scaf 2165 pos 1	обратный Cep120481	intron 23	centrosomes-associated cell division
mLP14 (PL1-2)	scaf 832 pos 117635	Aacs	reverse, reverse	intron 5	fatty acid-synthesis during adipose tissue development
mLP15 (PL1-3)	scaf 262 pos 1571782	Aldh5a1	прямой, обратный0474
mLP16 (PL1-10)	scaf 1796 pos 188123	Smad6	forward, forward	intron 2	transcriptional regulation of BMP and TGF-β signaling pathways
mLP17 (PL1-11)	scaf 624 pos 2206187	unannotated region	forward	non-coding
mLP18 (PL1-17)	scaf 1753 pos 117475	unannotated region	reverse	non-coding
mLP19 (PL1-20)	scaf 1149 pos 49532	Ptprq	reverse, forward	intron 8	cellular proliferation and differentiation
sLP20 b (Rosa-B12)	scaf 2241 pos 132202	Локус Rosa26 (ниже по течению до Thumpd3)	реверс, реверс	некодирующий

.0478 unannotated region 

клон LP .	Locus (подмости, позиция) .	Джин .	Относительная ориентация (по отношению к каркасу генома, ориентиру гена) .	Интрон/экзон .	Функция гена .
sLP1-1 a	scaf 1924	неаннотированная область	реверс	non-coding
	pos 60148
sLP1-2 a	scaf 1361	unannotated region	reverse	non-coding
	POS 1075377
MLP2
MLP2		reverse	non-coding
	pos 414422
mLP3	scaf 5035	unannotated region	forward	non-coding
	POS 1864526
1 (
1. 0481	scaf 934	Bmp5	forward, reverse	intron 1	TGF-β pathway
	pos 837184
mLP5 (A8)	scaf 2625 pos 237547	Ssbp2	обратный, прямой	интрон 9	стабильность генома, подавление опухоли, клеточный рост
mLP6 (B5) 5 6 5 9 5 9 917	scaf 30481	Trmt6	reverse, reverse	intron 8	tRNAs post-translational modification
mLP7 (C2)	scaf 424 pos 177811	unannotated region	reverse	non-coding
mLP8 (C5)	scaf 2259 pos 86304	Clcc1	прямой, обратный	экзон 11	хлоридный канал во внутриклеточных компартментах
mLP9 (C10)	scaf 3405 pos 4675	Fam114a1 (Noxp20)	reverse, reverse	intron 1	apoptosis, regulation of cell proliferation
mLP10 (D9)	scaf 1727 pos 865981	Lrba	обратный, обратный	интрон 40	внутриклеточный везикулярный транспорт, секреция иммунных эффекторных молекул8266	unannotated region	reverse	non-coding
mLP12 (G8)	scaf 1485 pos 438214	Dcn	reverse, forward	intron 2	cellular matrix proteoglycan, tumor suppression, Путь TGF-β
mLP13 (G11)	scaf 2165 pos 1	Cep128	обратный, прямой	интрон 23	1 центросомы0481
mLP14 (PL1-2)	scaf 832 pos 117635	Aacs	reverse, reverse	intron 5	fatty acid-synthesis during adipose tissue development
mLP15 (PL1-3)	scaf 262 pos 1571782	Aldh5a1	forward, reverse	intron 4	breakdown of the neurotransmitter GABA
mLP16 (PL1-10)	scaf 1796 pos 188123	Smad6	forward, forward	intron 2	transcriptional regulation of BMP and TGF-β signaling pathways
mLP17 (PL1-11)	scaf 624 pos 2206187	unannotated region	forward	non -Кодирование
MLP18 (PL1-17)	SCAF 1753 POS 117475	Неуносированная область	Обратный	НОННАНСКАЯ ДЕЛИНАЯ		НОННАНТАТА		НОННАНТАТА		НЕВОН0474
mLP19 (PL1-20)	scaf 1149 pos 49532	Ptprq	reverse, forward	intron 8	cellular proliferation and differentiation
sLP20 b (Rosa-B12)	scaf 2241 POS 132202	Locus Rosa26 (вниз по течению до Thumpd3)	Обратный, обратный	не кодирующий

^A 847

^A 847

^A 847

^A 847

^A 847

^{A сконструированы как посадочные площадки с единой интеграцией с CRISPR-Cas9.}

^b sLP20 был идентифицирован путем поиска гомологии последовательностей генома CHO-K1 с последовательностью Rosa26 мыши и сконструирован с помощью CRISPR-Cas9.

Открыть в новой вкладке

Затем мы стремились исследовать возможные общие функциональные и транскриптомные особенности, общие для этих аннотированных локусов. С этой целью мы сначала исследовали распределение человеческих и мышиных ортологов этих генов по путям KEGG (31). Мы обнаружили, что 3 из 12 генов — Bmp5, Dcn и Smad6 — находятся в пути трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), что значительно превышает представленность по сравнению со случайным распределением (9).0213 P = 1,7 × 10 ^-5 , FDR = 0,005 с использованием человеческих ортологов; P = 1,2 × 10 ^-5 , FDR = 0,003 с использованием мышиных ортологов). Мы также искали чрезмерную представленность генных сигнатур в литературе и обнаружили обогащение в наборе генов, который соответствует сигнатуре, которая различает разные категории взрослых почечных клеток-предшественников/стволовых клеток (39). Наблюдаемое обогащение связано с шестью генами нашего набора LP, Dcn, Clcc1, Ssbp2, Smad6, Fam114a1 и Lrba. Мы также обнаружили, что сайты интеграции обычно имеют значительно более высокие уровни экспрессии, чем другие гены, не относящиеся к домашнему хозяйству, в клетках CHO-K1, но ниже, чем гены домашнего хозяйства (дополнительная фигура S6). В совокупности эти результаты позволяют предположить, что закономерности, наблюдаемые при интеграции лентивирусов, не являются случайными, что согласуется с предыдущими наблюдениями (5–9).). Одним из возможных преимуществ интеграции может быть соседство с активно транскрибируемыми генами; например, активация пути TGF-β в условиях клеточной культуры наблюдалась для различных типов клеток млекопитающих (40). Предположительно, интеграция большого количества полезной нагрузки в эти гены нарушила бы их экспрессию, либо нарушив кодирующую последовательность, либо помешав сплайсингу, но дополнительные копии генов на других аллелях могли бы это компенсировать. Необходим дальнейший анализ, чтобы выяснить, дерегулирует ли вставка LP экспрессию генов интеграции и соседних генов.

Реконструкция выбранных посадочных площадок с помощью CRISPR/Cas9

Некоторые стратегии конструирования клеточных линий требуют многократных крупномасштабных интеграций, что значительно облегчается клеточными линиями, содержащими несколько LP. Эти клеточные линии могут быть получены с использованием сайт-специфической интеграции в недавно открытые стабильные локусы интеграции. Таким образом, мы стремились проверить, можно ли использовать новые сайты интеграции для целевой (невирусной) интеграции и реконструкции клеточных линий LP и сохраняют ли полученные клеточные линии стабильность экспрессии лентивирусных LP. Для этой цели мы сконструировали семь одиночных клеточных линий LP (sLP) с использованием CRISPR/Cas9., включая sLP1-1 и sLP1-2 (LP с одинарной интеграцией в локусах 1 и 2 клона mLP1 с двойной интеграцией), sLP2, sLP3, sLP6, sLP8 и sLP20 (рис. 2A–C; полный список см. в дополнительной таблице S4). все клоны LP и их конфигурации). Сайты интеграции были выбраны на основе уровней стабильности и экспрессии EYFP и mAb (рис. 1D и E), но, учитывая низкую вариацию между LP, наш выбор был несколько произвольным. Мы спроектировали сайты вставки так, чтобы они находились в пределах 1 т.п.н. от локусов интеграции, идентифицированных в лентивирусных клонах, при этом основные различия между sLP и соответствующим клоном mLP заключаются в наличии вирусных LTR, которые фланкируют интегрированный зонд LP в лентивирусных mLP, и точном место интеграции благодаря Cas9/ Ограничения по нацеливанию на геном гРНК (рисунки 1A и 2A; дополнительная таблица S2).

После Cas9-опосредованной вставки и отбора на экспрессию LP мы провели FACS для создания клональных клеточных линий и отобрали стабильные клоны на основе экспрессии флуоресцентного репортера. Выбранные клоны были проверены с помощью ряда геномных тестов, включая анализ копий гена и саузерн-блоттинг (рис. 2B и C), а также диагностическую ПЦР для целевой и нецелевой интеграции (дополнительная фигура S7A). Правильный Cas9опосредованная эффективность интеграции варьировала для разных локусов, в пределах от ~5% (sLP1-1) до ~50% (sLP20) в отобранных стабильно экспрессирующих клонах. Для сайта Rosa26 в дополнение к клонам одиночной интеграции (sLP20, клоны B2 и B12) мы также создали биаллельные интегранты, несущие двойную копию LP в двух аллелях предполагаемого локуса Rosa26 (biLP20, клоны B7 и B11). ) (рис. 2B и C).

Мы использовали те же методы для характеристики экспрессии генов из целевых линий LP, которые мы разработали для характеристики линий лентивирусной вставки. Экспрессия флуоресцентного белка была стабильной в течение 2 месяцев размножения клеток в отсутствие отбора антибиотиков и демонстрировала уровни экспрессии, аналогичные их гомологам mLP (рис. 2D и дополнительная фигура S7B). Интересно, что уровни экспрессии Cas9сконструированные sLP были даже более стабильны, чем из лентивирусных mLP, демонстрируя плотное и однородное распределение уровней стабильности (> 99% клеток EYFP+ после 2 месяцев культивирования клеток в отсутствие селекции; рисунок 2D) и слабую корреляцию между EYFP уровни и титры mAb (дополнительная фигура S5B). Примечательно, что биаллельный LP Rosa26 (biLP20) был столь же стабилен, как и моноаллельный LP Rosa26 (sLP20), но демонстрировал примерно в 2 раза более высокую флуоресценцию EYFP из-за дополнительной копии LP, что позволяет предположить, что комбинация стабильных одиночных LP может дают стабильную мульти-LP клеточную линию с пропорционально повышенным уровнем экспрессии.

Мы также интегрировали полезную нагрузку, экспрессирующую JUG444, в линии LP, сгенерированные CRISPR/Cas9, и количественно определили титры антител в пулах интегрантов mAb (рис. 2E и дополнительный рисунок S7C). Все клоны демонстрировали стабильную экспрессию mAb в течение одного месяца размножения клеток в отсутствие селекции, а титры были сходны с титрами, наблюдаемыми с соответствующими МЛП. Как и в случае экспрессии EYFP, biLP20 демонстрирует стабильную экспрессию mAb с примерно в 2 раза более высокими титрами по сравнению с LP20 из-за дополнительной копии mAb, интегрированной во вторую LP. В целом эти данные подтверждают, что стабильные локусы интеграции, обнаруженные с помощью лентивирусного скрининга, могут быть успешно реконструированы с помощью CRISPR-Cas9. , а свойства лентивирусных клонов (такие как долговременная стабильная экспрессия LP и интегрированная полезная нагрузка) повторяются в сконструированных клонах.

Создание и использование платформы с несколькими LP для создания клеточных линий

После успешной реконструкции стабильных одиночных LP с использованием подхода редактирования генов мы сосредоточились на создании клеточных линий, несущих LP, интегрированных в несколько стабильных геномных сайтов. Эти дизайнерские клеточные линии могут стать базовой платформой для сайт-специфической хромосомной интеграции различных полезных нагрузок ДНК в несколько хромосомных участков, что позволяет быстро и эффективно создавать стабильные клеточные линии для различных биологических и биотехнологических приложений. Для создания клонов с несколькими LP мы использовали CRISPR/Cas9.для последовательной интеграции нескольких кассет LP, кодирующих различные полезные нагрузки репортера/отбора (EYFP-2A-Hygro или EBFP-2A-Bla), окруженных гомологическими плечами, специфичными для локуса (дополнительная фигура S8A и таблица S4). Четыре сайта интеграции (LP1-2, LP2, LP15 и LP20) были выбраны для конструирования нескольких LP на основании данных о стабильности sLP и mLP (рис. 1 и 2) и эффективности Cas9-опосредованной интеграции в различные локусы. Был создан ряд клеточных линий с несколькими LP, в том числе двойные LP-линии dLP1 (LP2/LP15) и dLP2 (LP1-2/LP2) и тройной LP tLP1 (biLP20/LP2; дополнительная фигура S8A). Все клоны были подтверждены диагностической ПЦР, анализом копий генов и Саузерн-блоттингом (дополнительные рисунки S8B и C). Как и в предыдущих результатах, исследования стабильности экспрессии показали сильную и стабильную экспрессию EYFP и EBFP для всех клонов dLP и tLP в течение как минимум 2 месяцев культивирования клеток в отсутствие отбора (дополнительная фигура S9).). Это подтвердило, что генетически стабильные клеточные линии, содержащие платформу с несколькими LP, могут быть сконструированы из различных комбинаций недавно обнаруженных нами стабильных одиночных LP.

Чтобы проверить полезность нашей мульти-LP платформы для производства рекомбинантного белка с использованием целевой интеграции полезной нагрузки с несколькими сайтами, мы использовали интеграцию ДНК, опосредованную рекомбиназой, для вставки полезной нагрузки 1x-hEF1a-mAb (дополнительный рисунок S4A) в одиночную, двойную и тройные клеточные линии LP, и измеряли титры антител с течением времени для оценки относительных уровней экспрессии белка и долгосрочной стабильности. Однократная интеграция полезной нагрузки mAb в линии с двойной или тройной LP дает смесь интегрантов mAb, которые можно разделить на отдельные популяции с помощью комбинированной стратегии отбора антибиотиков и/или стратегии сортировки FACS, как показано на рисунке 3. Например, отбор интегранты dLP1 с пуромицином и бластицидином дают пул EBFP+ с одной копией mAb, интегрированной в локус LP2, но оставляют нетронутым локус LP15, экспрессирующий EBFP-2A-бластицидин; отбор с использованием пуромицина и гигромицина дает пул EYFP+ с одной копией mAb, интегрированной в локус LP15, в то время как отбор только с использованием пуромицина и сортировка на двойные негативные клетки EYFP-/EBFP- дают двойные интегранты mAb (рис. 3). Альтернативно, каждая из трех различных популяций может быть выделена путем отбора пуромицином с последующим FACS. Этот подход позволил нам специально нацелить полезную нагрузку на разные локусы клонов с несколькими LP и, таким образом, создать все возможные комбинации LP-полезная нагрузка за одну трансфекцию.

Рисунок 3.

Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

Платформа с несколькими LP позволяет параллельно создавать клоны, выражающие различные полезные нагрузки, путем однократной интеграции полезных нагрузок. ( A ) Схематическое изображение интеграции полезной нагрузки mAb в клеточную линию dLP1. Клон dLP1 содержит сайты LP2 и LP15, каждый из которых несет сайт attP BxB1. Опосредованная BxB1 рекомбинация происходит между сайтом attP LP и сайтом attB полезной нагрузки с образованием смеси одиночных интегрантов (LP2-mAb и LP15-mAb) и двойного интегранта (dLP1-mAb). ( B ) Диаграммы проточной цитометрии и схемы отбора различных пулов интегрантов LP-mAb после интеграции полезной нагрузки mAb в клон dLP1. Специфическая для сайта интеграция полезной нагрузки mAb в сайт LP запускает экспрессию беспромоторного маркера селекции полезной нагрузки (пуромицина), в то время как экспрессия кассеты LP прекращается. Соответствующие схемы отбора антибиотиков и сортировка с помощью FACS позволяют выделить три типа пулов интегрантов LP-mAb, в которых полезная нагрузка mAb интегрирована только в сайт LP2 (LP2-mAb), только в сайт LP15 (LP15-mAb) или в оба (dLP1-mAb). ). Небольшие остаточные популяции неинтегрированных LP (например, популяция EYFP+ в пуле LP2-mAb и популяция EBFP+ в пуле LP15-mAb) могут быть удалены с помощью сортировки FACS.

Отобранные и отсортированные пулы клеток, а также клональные интегранты, выделенные из каждой популяции, размножались в течение 1 месяца без селекции и еженедельно анализировались на титры mAb (дополнительная фигура S10). Все клоны демонстрировали стабильную экспрессию mAb, и титры увеличивались линейно в зависимости от количества сайтов LP, интегрированных с полезной нагрузкой mAb. Таким образом, двойные и тройные интегранты демонстрировали примерно в 2 и 3 раза более высокие титры по сравнению с одним интегрантом mAb (рис. 4 и дополнительная фигура S10).

Рисунок 4.

Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

Стабильная и повышенная экспрессия mAb с использованием мультикопийных схем mAb, интегрированных в платформу multi-LP. ( A ) Схематические диаграммы конфигураций LP в одиночных (sLP2), двойных (dLP1) и тройных (tLP1) клеточных линиях LP, используемых для интеграции полезной нагрузки нескольких mAb. ( B ) Еженедельные титры mAb клональных интегрантов sLP2-mAb и dLP1-mAb, несущих многокопийные конструкции mAb в разных сайтах LP. Конструкции mAb интегрировали в dLP1, и отбирали и клонально сортировали различные пулы интегрантов LP-mAb, несущих полезную нагрузку mAb в одиночных (LP2 или LP15) или двойных (dLP1) локусах. Например, dLP2-hEF1a-mAb с 1 и 2 кассетами mAb были сконструированы путем отбора и сортировки клональных интегрантов полезной нагрузки 1x-hEF1a-mAb в одиночных (LP2 или LP15) или двойных (LP2/LP15) локусах соответственно. Клональные интегранты mAb размножали в отсутствие селекции, и уровни mAb еженедельно измеряли в кондиционированных средах. Каждая полоса представляет 1 неделю размножения клеток и измерений mAb (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 2 или 3). ( C ) Титры антител клональных интегрантов tLP1-mAb, стабильно экспрессирующих многокопийные полезные нагрузки mAb, интегрированные в одиночные (LP2), двойные (biLP20) или тройные (LP2/biLP20) локусы в клоне tLP1. Конструкции mAb были интегрированы в tLP1, и были отобраны и клонально отсортированы различные пулы интегрантов LP-mAb, несущих полезную нагрузку mAb в одиночном (LP2), двойном (biLP20) или тройном (biLP20/LP2) локусах. Например, tLP1-hEF1a-mAb с 1, 2 и 3 кассетами mAb были сконструированы путем отбора и сортировки клональных интегрантов полезной нагрузки 1x-hEF1a-mAb в одиночных (LP2), двойных (biLP20) или тройных (biLP20/LP2) локусах, соответственно. Клональные интегранты размножали в отсутствие селекции, и еженедельно измеряли уровни mAb в кондиционированных средах. Каждая полоса представляет 1 неделю размножения клеток и измерений mAb (среднее значение ± стандартное отклонение, n = 2 или 3). В таблице под графиком указаны локусы LP, интегрированные с полезной нагрузкой, интегрированная полезная нагрузка mAb и общее количество интегрированных кассет mAb. Число копий гена mAb всех клональных интегрантов подтверждали с помощью ddPCR.

Основываясь на приведенных выше наблюдениях за повышенной продукцией mAb в клонах с несколькими LP, мы использовали две стратегии для дальнейшего усиления экспрессии mAb: увеличение количества копий mAb путем интеграции многокопийных полезных нагрузок mAb в платформу с несколькими LP и использование более сильного промотора. для управления экспрессией mAb. Мы сконструировали векторы с несколькими mAb, экспрессирующие две и три копии mAb под промотором hEF1a (2x-hEF1a-mAb и 3x-hEF1a-mAb соответственно) и полезную нагрузку, экспрессирующую одну копию mAb под более сильным промотором, CMV (дополнительная фигура S4A). . Четыре конструкции mAb (1x-, 2x-, 3x-hEF1a-mAb и 1x-CMV-mAb) были интегрированы в клеточные линии sLP2, dLP1 и tLP1. Эффективность интеграции снижалась по мере увеличения размера полезной нагрузки ДНК и количества интегрированных сайтов LP, но была достаточно высокой, чтобы занимать все сайты платформы с несколькими LP с помощью однократной интеграции (рис. 3). Например, интеграция полезной нагрузки тройного mAb (3x-hEF1a-mAb; 33 kb) в тройной LP (tLP1) дала примерно 5, 2 и 1% одиночных, двойных и тройных интегрантов LP-mAb соответственно. Пулы одиночных, двойных и тройных интегрантов затем отбирали комбинацией отбора антибиотиков и сортировки, как описано выше.

Для более точного измерения титра мы выделили клональные клеточные линии из пулов интегрантов mAb. Клональные интегранты были проверены с помощью диагностической ПЦР, анализа копий генов и Саузерн-блоттинга выбранных клонов (дополнительные рисунки S11 и 12). Анализ копий гена подтвердил, что большинство клонов-кандидатов на интеграцию LP-mAb содержат до 6 копий mAb (15/20 правильных), в то время как только 1/6 клонов-кандидатов с девятью копиями mAb имеют правильное число копий гена, а остальные пять имеют более низкий ген. номер копии (дополнительный рисунок S12). Это могло быть вызвано несколькими факторами, включая генетическую нестабильность высокоповторяющейся полезной нагрузки 3x-hEF1a-mab, недостаточный рост 9-копировать интегранты mAb или более высокий процент неправильных интегрантов в относительно небольшой популяции тройных интегрантов для этой большой полезной нагрузки. Тем не менее, все проверенные мульти-LP интегранты с общим числом копий mAb от одной до девяти, включая клеточную линию, полученную из tLP1, интегрированную с тремя копиями конструкции 3x-hEF1a-mAb, которая несет в общей сложности ~100 т. п.н. гетерологичной ДНК (21 транскрипционный единиц), демонстрировали стабильную долгосрочную экспрессию mAb (рис. 4) и нормальную скорость роста без морфологических аномалий. Для конструкций hEF1a титры mAb увеличивались пропорционально количеству интегрированных кассет mAb, при этом тройной LP, интегрированный с 3x-hEF1a-mAb, экспрессировал ~9в несколько раз более высокие титры по сравнению с одной копией 1x-hEF1a-mAb, интегрированной в одну LP (sLP2) (рис. 5). Более сильный промотор в конструкции 1x-CMV-mAb давал примерно в 3 раза более высокий титр по сравнению с полезной нагрузкой 1x-hEF1a-mAb, а интеграция 1x-CMV-mAb в двойные и тройные линии LP приводила к дополнительному увеличению титра (до в 3 раза) в хорошей корреляции с количеством кассет mAb в полезной нагрузке (фиг. 5). В целом, эти данные демонстрируют, что клеточные линии, несущие несколько LP, пригодны для стабильной интеграции больших количеств гетерологичной ДНК быстрым и воспроизводимым образом с контролем числа копий трансгена и специфичности интеграции. Линейное увеличение титра mAb с использованием нашей платформы с несколькими LP, интегрированной с полезными нагрузками с несколькими копиями ДНК, предполагает, что экспрессия из трех LP в этих условиях независима. Кроме того, пропорциональность между числом копий трансгена и титром mAb может представлять собой новую стратегию повышения уровня экспрессии рекомбинантных белков контролируемым и предсказуемым образом, когда другие факторы, такие как способность секреторного пути, не ограничивают клеточную продуктивность.

Рисунок 5.

Открыть в новой вкладкеСкачать слайд

Линейное увеличение титров mAb с использованием мультикопийных схем mAb, интегрированных в платформу multi-LP. Титры антител интегрантов цепей hEF1a-mAb и CMV-mAb sLP2-mAb и dLP1-mAb ( A ) и tLP1-mAb ( B ) показаны относительно общего количества интегрированных кассет mAb. Общее количество кассет mAb представляет собой количество интегрированных сайтов LP, умноженное на количество копий mAb в векторе полезной нагрузки mAb. Титры mAb рассчитывали из анализа стабильности mAb (фиг. 4) как средние значения титра за 5 недель анализа стабильности (среднее значение ± стандартное отклонение).

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы использовали лентивирусный скрининг для обнаружения 20 сайтов геномной интеграции, которые поддерживают эффективную и стабильную экспрессию гетерологичных генов в клетках СНО. Мы также идентифицировали предполагаемый сайт Rosa26 в геноме CHO-K1. Используя CRISPR/Cas9, мы интегрировали LP в несколько недавно идентифицированных локусов и воспроизвели ту же надежную и однородную долгосрочную экспрессию интегрированных полезных нагрузок ДНК, которую мы наблюдали в лентивирусных клеточных линиях. Наконец, мы создали клеточные линии с несколькими LP и продемонстрировали их пригодность для экспрессии рекомбинантных белков. Такие клеточные линии с несколькими LP позволяют целенаправленно интегрировать множество больших полезных нагрузок ДНК в четко определенные хромосомные контексты, что может иметь широкое применение в биопроизводстве и синтетической биологии млекопитающих.

Геномные локусы «безопасной гавани» обеспечивают предсказуемую экспрессию интегрированных трансгенов без неблагоприятного изменения клеточной функции (41). Мы использовали лентивирусную инфекцию для скрининга локусов-кандидатов на интеграцию, поскольку полногеномные исследования показали, что лентивирусы преимущественно встраиваются вблизи активно транскрибируемых генов (6–9), и, таким образом, эти сайты могут поддерживать стабильную экспрессию трансгенов. Действительно, мы обнаружили значительно более высокую экспрессию эндогенных генов в сайтах интеграции лентивирусов (дополнительная фигура S6) по сравнению с другими сайтами в геноме, что может указывать на то, что эти локусы относительно открыты и транскрипционно активны. Мы также наблюдали значительное чрезмерное представительство сигнального пути TGF-β среди этих генов, что может быть результатом активированного ответа эпителиально-мезенхимального перехода на культуральную систему (40,42). Интересно, что 20/21 сайтов интеграции находятся в некодирующих областях или интронах генов. Подобное обогащение некодирующих и интронных областей наблюдалось в горячих точках транскрипции в геноме человека (43). Будущий анализ большего набора стабильных сайтов интеграции может помочь выяснить геномные особенности, которые делают определенные локусы лучшими LP, а также может привести к лучшим критериям для идентификации предполагаемых стабильных сайтов интеграции в клетках млекопитающих.

Чтобы подтвердить функциональность клеточных линий CHO, содержащих несколько LP, и их пригодность для биопроизводства, мы использовали их для создания клеточных линий для производства моноклональных антител. Традиционная разработка клеточных линий, продуцирующих mAb, путем случайной интеграции часто дает клоны с гетерогенной, нестабильной экспрессией трансгенов и требует трудоемких исследований стабильности для получения готовой к производству клеточной линии (24, 44–46). Напротив, подходы, опосредованные рекомбиназой, позволяют вставлять полезные нагрузки ДНК в предварительно выбранные и проверенные сайты интеграции, обеспечивая полный контроль над хромосомным контекстом и количеством копий интегрированных трансгенов (14–16). Здесь мы демонстрируем создание и полезность платформы с несколькими LP, которая позволяет интегрировать большие полезные нагрузки ДНК в локусы, которые поддерживают предсказуемую и стабильную экспрессию трансгенов. Однократная интеграция большой полезной нагрузки mAb (∼33 т.п.н.) в тройной LP привела к занятию всех трех участков LP с разумной эффективностью (∼1% до отбора), а весь процесс разработки и проверки интеграции моноклональных тройных mAb клеточных линий было достигнуто примерно через 3 недели. Мы не наблюдали снижения продукции mAb в течение > 1 месяца размножения клеток без селекции, а также снижения скорости роста клонов с одним и несколькими LP, несущими до ~100 т.п.н. интегрированной полезной нагрузки ДНК (тройной LP, несущий 3x-mAb). построить). Кроме того, объединение платформы с несколькими LP с многокопийной полезной нагрузкой mAb привело к линейному увеличению титра mAb до девяти копий mAb. Для большего количества LP эффективность единовременной интеграции во все сайты может упасть ниже практического уровня выбора, и в этом случае вместо этого следует использовать последовательную интеграцию, чтобы обеспечить интеграцию в дополнительные сайты. Следует отметить, что линейная зависимость не обязательно сохраняется в условиях высокой экспрессии, когда другие факторы, такие как способность секреторного пути, становятся узким местом для клеточной продуктивности (47).

Уровни экспрессии mAb, которые мы наблюдали, умеренно низкие по сравнению с промышленными стандартами из-за использования мелкомасштабного процесса производства mAb в 24-луночном планшете и прикрепленных клетках CHO-K1, которые не оптимизированы для продукции белка. Наши титры нельзя напрямую сравнивать с промышленными титрами, полученными в ходе сильно оптимизированных процессов биопроизводства с использованием оптимизированных штаммов CHO и условий роста, запатентованных сред и расширенных биореакторных процессов (24). Недавнее исследование фактически показало, что оптимизированный процесс биопроизводства может давать промышленно приемлемые титры (∼1 г/л) с использованием одного LP для экспрессии mAb (48). Применение нашей проверенной концептуальной многосайтовой интеграционной платформы к соответствующему производственному хосту CHO может привести к дальнейшему совершенствованию таких систем.

Клеточные линии, несущие несколько LP, которые поддерживают стабильную долгосрочную экспрессию генов, также могут стать катализатором новых достижений в синтетической биологии млекопитающих. В сочетании с недорогими технологиями синтеза генов и модульного клонирования клетки-посадочные площадки могут обеспечить высокопроизводительное конструирование и определение характеристик синтетических генных сетей в клетках млекопитающих, что может привести к новым генным и сконструированным клеточным методам лечения заболеваний человека. Подход с несколькими LP особенно интересен в этом контексте, потому что он позволяет быстро создавать комбинаторные варианты: одна полезная нагрузка ДНК может оставаться постоянной, а другие варьируются, или множество возможных вариантов могут быть объединены на одном этапе интеграции для создания разнообразной библиотеки. клонов. Наконец, множественные сайты интеграции могут помочь поддерживать независимую экспрессию из разных частей цепи синтетического гена: ситуации, когда требуется несколько единиц транскрипции, но известно, что они мешают друг другу, могут быть разделены на разные геномные локусы и, таким образом, изолированы друг от друга.

В заключение, наша мульти-LP платформа обеспечивает надежную и предсказуемую вставку больших полезных нагрузок в хорошо охарактеризованные сайты в геноме CHO-K1. Будущая оптимизация платформы с несколькими LP может включать использование ортогональных сайтов рекомбинации (например, мутантов BxB1) для опосредованного рекомбиназой обмена кассетами и одноразовой интеграции библиотек полезной нагрузки ДНК (49). Вместе эти технологии обещают улучшения в инженерии клеточных линий для приложений, включая экспрессию синтетических генов и генных цепей, сверхэкспрессию генов для исследований функциональной генетики, эктопическую экспрессию генов для репрограммирования и конверсии клонов, вставку репортеров для исследований по отслеживанию клонов и создание высокопродуктивных терапевтические белковые экспрессеры для биопроизводства.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны на сайте NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Мы благодарим доктора Самиру Киани (Университет штата Аризона) за помощь в разработке клеток CRISPR/Cas9; William CW Chen, Na Li, Jonathan Lyles и Cong Liu за помощь в работе с культурой клеток млекопитающих; д-ру Mara C. Inniss и Jianlin Chu за помощь в генетическом анализе; Доктор Джой Римчала и Адриан Слюсарчик за помощь в открытии лентивирусных LP; доктору Сепиде Долатшахи за помощь в биоинформатическом анализе; д-ру Bruno Figueroa за помощь в анализе РНКсек; доктору Рону Кризу и профессору Дугласу А. Лауффенбургеру за их постоянную поддержку и вклад в ходе исследования; Профессору Монти Кригеру за критическое прочтение рукописи.

Вклад авторов : L.G., L.W., N.M.S., T.K.L., L.Z. и исследование, разработанное RW; Л.Г., Л.В., X.Z., Ю.Л., К.Дж., С.М., В.А.Т. и А.Л. провели исследование; Т.Н., Д.Д., К.Б. и С.Б. предоставил новые реагенты/аналитические инструменты; Л.Г., Л.В., Б.Т., Т.Н., Дж.Д., Л.З. и RW проанализировали данные; и Л. Г., Л. В., Б. Т. и Р. В. написали статью.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

CHO2.0 Сотрудничество Pfizer-MIT; Премия Национального научного фонда [CNS-1446474 to BT]. Финансирование платы за открытый доступ: сотрудничество CHO2. 0 Pfizer-MIT.

Заявление о конфликте интересов . Ни один не заявил.

ССЫЛКИ

1.

Кинч

М.С.

Обзор биопрепаратов, одобренных FDA

.

Наркотики Дисков. Сегодня

.

2015

;

20

:

393

–

398

.

2.

Вурм

Ф.М.

Производство терапевтических рекомбинантных белков в культивируемых клетках млекопитающих

.

Нац. Биотехнолог.

2004

;

22

:

1393

–

1398

.

3.

Slusarczyk

A.L.

,

LIN

A.

,

Weiss

R.

Фонды для проектирования и реализации синтетических генетических циркетов

.

Нац. Преподобный Жене.

2012

;

13

:

406

–

420

.

4.

Bacchus

W.

,

Aubel

D.

,

Fussenegger

M.

Биомедически значимые стратегии с цепи в синтетической биологии мммика

.

Мол. Сист. биол.

2013

;

9

:

691

–

702

.

5.

Шотт

Дж.В.

,

Hoffmann

D

,

Schambach

A

Курс. мнение Фармакол.

2015

;

24

:

135

–

146

.

6.

Каттольо

К.

,

Facchini

G.

,

Sartori

D.

,

Antonelli

A.

,

Miccio

A.

,

Cassani

B.

,

Schmidt

M.

,

Von Kalle

C.

,

Howe

S.

,

Thrasher

A.J.

и др.

Горячие точки ретровирусной интеграции в CD34+ гемопоэтических клетках человека

.

Кровь

.

2007

;

110

:

1770

–

1778

.

7.

WU

X.

,

LI

Y.

,

CRISE

B.

,

Burges

S.M.

Области начала транскрипции в геноме человека являются предпочтительными мишенями для интеграции MLV

.

Наука

.

2003

;

300

:

1749

–

1751

.

8.

Шредер

А.Р.В.

,

Shinn

P.

,

Chen

H.

,

Berry

C.

,

Ecker

J.R.

,

Bushman

F.

Интеграция ВИЧ-1 в геном человека способствует активным генам и локальным очагам

.

Сотовый

.

2002

;

110

:

521

–

529

.

9.

Desfarges

S.

,

Ciuffi

A.

Выбор места интеграции ретровируса

.

Вирусы

.

2010

;

2

:

111

–

130

.

10.

Кузницы

О.

,

Грегг

Р.Г.

,

Боггс

С.С.

,

Коралевский

М.А.

,

Кучерлапати

3 Р.С.

Вставка последовательностей ДНК в хромосомный локус β-глобина человека путем гомологичной рекомбинации

.

Природа

.

1985

;

317

:

230

–

234

.

11 .

,

AACH

J.

,

Guell

M.

,

Dicarlo

J.E.

,

Норвиль

J.E.

,

Церковь

G.M.

РНК-управляемая инженерия генома человека с помощью Cas9

.

Наука

.

2013

;

339

:

823

–

826

.

12.

Гай

Т.

,

Герсбах

К.А.

,

Барбас

К.Ф.

Методы геномной инженерии на основе ZFN, TALEN и CRISPR/Cas

.

Тенденции биотехнологии.

2013

;

31

:

397

–

405

.

13.

Cristea

S.

,

Freyvert

Y.

,

Santiago

Y.

,

Holmes

M.C.

,

Урнов

Ф.Д.

,

Грегори

П. Д.

,

Стоимость

Г.Дж.

Расщепление трансгенных доноров in vivo способствует целевой интеграции, опосредованной нуклеазами

.

Биотехнология. биоинж.

2013

;

110

:

871

–

880

.

14.

O’Gorman

S.

,

FOX

D.

,

WAHL

G.

-опосредованная рекомбиназой активация гена и специфическая для участка интеграция в маломеальных ячеек

Активация гена и специфическая для участка в маломеальных ячейках

.0003

.

Наука

.

1991

;

251

:

1351

–

1355

.

15.

Duportet

X.

,

Wroblewska

L.

,

Guye

P.

,

Li

Y.

,

Eyquem

J

,

Ридерс

Дж.

,

Rimchala

T.

,

BATT

G.

,

Weiss

R.

Платформа для быстрого прототипирования синтетических ген -сети в маммических клетках

4.

Рез. нуклеиновых кислот.

2014

;

42

:

13440

–

13451

.

16.

Туран

С.

,

Зехе

C.

,

Kuehle

J.

,

Qiao

J.

,

Bode

J.

Рецепционно-опосредованный кассет для целенаправленных геномных модификаций

.

Джин

.

2013

;

515

:

1

–

27

.

17.

Туран

S.

,

Kuehle

J.

,

Schambach

A.

,

BAUM

C.

,

J.

Multiply Suppetiping Riled. расширения технологии замены кассет, опосредованной Flp-рекомбиназой

.

Дж. Мол. биол.

2010

;

402

:

52

–

69

.

18.

BASER

B.

,

SPEHR

J.

,

Büssow

K.

,

Van Den Heuvel

J.

,

Van Den Heuvel

J.

ATHINGIL два независимых сайта геномной интеграции для совместной экспрессии генов в клетках СНО

.

Методы

.

2016

;

95

:

3

–

12

.

19.

Чжан

Л.

,

Иннисс

М.К.

,

HAN

S.

,

MOFFAT

M.

,

Jones

H.

,

Zhang

B.

,

COX

B.

,

COX

B.

,

COX

B.

,

COX

B.

,

.

,

Рэнс

Дж. Р.

,

Янг

Р.Дж.

Опосредованная рекомбиназой замена кассет (RMCE) для экспрессии моноклональных антител в коммерчески значимой клеточной линии CHOK1SV

.

Биотехнология. прог.

2015

;

31

:

1645

–

1656

.

20.

Crawford

Y.

,

Zhou

M.

,

Hu

Z.

,

Joly

J.

,

Snedecor

B

,

Шен

А.

,

Gao

A.

Быстрая идентификация надежных хозяев для разработки целевых клеточных линий на основе скрининга ограниченного генома с использованием комбинированных технологий интегразы φC31 и CRE-Lox

.

Биотехнология. прог.

2013

;

29

:

1307

–

1315

.

21.

Чжоу

Х.

,

Лю

Z.

,

Sun

Z.

,

Huang

Y.

,

Yu

W.

Генерация стабильных клеточных линий китайских трансгенов Fhamsterov с помощью сайт-специфичной интеграции Система FRT

.

Дж. Биотехнолог.

2010

;

147

:

122

–

129

.

22.

Нельсен

K.

,

Schucht

R.

,

da Gama-Norton

L.

,

Krömer

W.

,

Baer

A.

,

Cayli

A.

,

Hauser

H.

,

Wirth

D.

Экспрессия рекомбинантного белка путем нацеливания на предварительно отобранные хромосомные локации

.

Биотехнология BMC.

2009

;

9

:

100

–

111

.

23.

Kito

M.

,

ITAMI

S.

,

Fukano

Y.

,

T.

T.0003

.

Конструирование сконструированных штаммов cho для продукции высокого уровня рекомбинантных белков

.

Заявл. микробиол. Биотехнолог.

2003

;

60

:

442

–

448

.

24.

Вурм

Ф.М.

Производство терапевтических рекомбинантных белков в культивируемых клетках млекопитающих

.

Нац. Биотехнолог.

2004

;

22

:

1393

–

1398

.

25.

Лоис

К.

,

Хонг

Э.Дж.

,

Пиз

С.

,

Браун

Э.Дж.

,

Baltimore

D.

Зародышевая передача и тканеспецифическая экспрессия трансгенов, доставляемых лентивирусными векторами

.

Наука

.

2002

;

295

:

868

–

872

.

26.

Engler

C.

,

Gruetzner

R.

,

Kandzia

R.

,

Marillonnet

S.

Golden Gate: Ane-Shaffling: A One-gatuffling: Ane-gatuffling: Ane- gothffling: Ane- a Golden-Gatuflling: Ane- a Golden-Gatuffling: A One- gotuffling:

. метод перетасовки ДНК в горшках на основе ферментов рестрикции типа II

.

PLoS One

.

2009

;

4

:

e5553

.

27.

Guye

P.

,

Li

Y.

,

Wroblewska

L.

,

Duportet

X.

,

Weiss

R

Быстрое, модульное и надежное конструирование сложных генных цепей млекопитающих

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2013

;

41

:

e156

.

28.

Altschul

S.F.

,

Мэдден

Т.Л.

,

Schäffer

А.А.

,

Zhang

J.

,

Zhang

Z.

,

Miller

W.

,

Lipman

D.J.

Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска белков в базе данных

.

Рез. нуклеиновых кислот.

1997

;

25

:

3389

–

3402

.

29.

Замбровиц

Б.П.

,

Imamoto

A.

,

Fiering

S.

,

Herzenberg

L.A.

,

Kerr

W.G.

,

Soriano

P.

Нарушение перекрывающихся транскриптов в штамме-ловушке гена ROSA beta geo 26 приводит к широкой экспрессии бета-галактозидазы в эмбрионах мышей и гемопоэтических клетках

.

Проц. Натл. акад. науч. США

1997

;

94

:

3789

–

3794

.

30.

Irion

S.

,

Luche

H.

,

Gadue

P.

,

Fehling

.J.J.J.

.J.J.

,

Келлер

Г.

Идентификация и нацеливание на локус ROSA26 в эмбриональных стволовых клетках человека

.

Нац. Биотехнолог.

2007

;

25

:

1477

–

1482

.

31.

Канехиса

М.

,

Гото

С.

Киотская энциклопедия генов и геномов

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2000

;

28

:

27

–

30

.

32.

Wang

J.

,

Duncan

D.

,

SHI

Z.

,

Zhang

B.

. (WebGestalt): обновление 2013

.

Рез. нуклеиновых кислот.

2013

;

41

:

W77

–

W83

.

33.

Хефзи

Х.

,

Анг

К.С.

,

Hanscho

M.

,

Bordbar

A.

,

Ruckerbauer

D.

,

Lakshmanan

M.

,

Orellana

C.A.

,

Байчин-Хизал

Д.

,

Huang

Y.

,

Ley

D.

и др.

Консенсусная реконструкция метаболизма клеток яичника китайского хомячка в масштабе генома

.

Сотовая система

2016

;

3

:

434

–

443

.

34.

Айзенберг

Э.

,

Леванон

Е.Ю.

Гены домашнего хозяйства человека, новый взгляд

.

Тенденции Genet.

2013

;

29

:

569

–

574

.

35.

Льюис

Н.В.

,

Liu

X.

,

Li

Y.

,

Nagarajan

H.

,

Yerganian

G.

,

O’Brien

Е.

,

Бордбар

А.

,

Рот

А.М.

,

Rosenbloom

J.

,

Bian

C.

и др.

Геномные ландшафты клеточных линий яичников китайского хомячка, выявленные с помощью проекта генома Cricetulus griseus

.

Нац. Биотехнолог.

2013

;

31

:

759

–

765

.

36.

Сюй

X.

,

Нагараджан

Х.

,

Льюис

.E

,

PAN

S.

,

CAI

Z.

,

Chen

W.

,

XIE

M.

,

Wang2

M.

,

Wang2

M.

,

Wang2

M.

,

Wang 2

M.

,

M.

,

,

Хаммонд

С.

,

Микаэль

Р.

и др.

Геномная последовательность клеточной линии яичника китайского хомячка (CHO) K1

.

Нац. Биотехнолог.

2012

;

29

:

735

–

741

.

37.

Haussler

M.

,

Schönig

K.

,

Eckert

H.

,

ESCHSTRUTH

H.

,

H.0002 A.

,

Mianne

J.

,

Renaud

J.-B.

,

Schneider-Maunoury

S.

,

Shkumatava

A.

,

Teboul

L.

,

Kent

J.

Et.

Оценка алгоритмов подсчета внецелевых и целевых показателей и интеграция в инструмент выбора направляющей РНК CRISPOR

.

Геном Биол.

2016

;

17

:

148

–

159

.

38.

Cong

L.

,

RAN

F.A.

,

COX

D.

,

S.

,

Barre

,

Хабиб

Н.

,

Хсу

П.Д.

,

Ву

Х.

,

Цзян

В.

,

Маррафини

Маррафини

Л.

Мультиплексная инженерия генома с использованием систем CRISPR/Cas

.

Наука

.

2013

;

339

:

819

–

823

.

39.

Саллюстио

Ф.

,

De Benedictis

L.

,

Castellano

G.

,

Zaza

G.

,

Loverre

A.

,

Costantino

V.

,

Грандалиано

Г.

,

Шена

Ф.П.

TLR2 играет роль в активации резидентных почечных стволовых клеток/клеток-предшественников

.

ФАСЭБ Дж.

2010

;

24

:

514

–

525

.

40.

Jäckel

C.

,

Nogueira

M.S.

,

Ehni

N.

,

Kraus

C.

,

Ranke

J.

,

Dohmann

M.

,

Noessner

E.

,

Nelson

P.J.

Векторная платформа для быстрого и эффективного конструирования стабильных комплексных трансгенов

.

Науч. Респ.

2016

;

6

:

34365

–

34373

.

41.

Садлен

М.

,

Папапетру

Е.П.

,

Бушмен

Ф.Д.

Безопасные гавани для интеграции новой ДНК в геном человека

.

Нац. Преподобный Рак

.

2011

;

12

:

51

–

58

.

42.

Мустакас

А.

,

Хелдин

К.-Х.

Механизмы индуцированного TGFβ эпителиально-мезенхимального перехода

.

Дж. Клин. Мед.

2016

;

5

:

63

–

96

.

43.

Ченг

Дж.К.

,

Льюис

А.М.

,

Ким

Д.С.

Выявление и перенацеливание горячих точек транскрипции в геноме человека

.

Биотехнология. Дж.

2016

;

11

:

1100

–

1109

.

44.

Пилбро

В.

,

Мунро

Т.П.

,

Серый

P.

Гетерогенность внутриклональной экспрессии белка в рекомбинантных клетках CHO

.

PLoS One

.

2009

;

4

:

e8432

.

45.

Латтенмайер

C.

,

Loeschel

M.

,

Steinfellner

W.

,

Trummer

E.

,

000

9000.

,

,

000

9000.

,

.

,

000

,

,

000

,

,

000

,

,

000

,

.

K.

,

Vorauer-UHL

K.

,

Katinger

H.

,

Kunert

R.

Идентификация трансгеновой интеграции Loci Loci из различных экспрессии высокой экспрессии. от РЫБЫ

.

Цитотехнология

.

2006

;

51

:

171

–

182

.

46.

Du

Z.

,

Mujacic

M.

,

Le

K.

,

Caspary

G.

,

Nunn

H

,

Хит

К.

,

Reddy

P.

Анализ гетерогенности и нестабильности стабильных mAb-экспрессирующих клеток CHO

.

Биотехнология. Биопроцесс инж.

2013

;

18

:

419

–

429

.

47.

Pieper

L.A.

,

Strotbek

M.

,

Wenger

T.

,

Gamer

M.

,

Olayioye

M.A.

,

Hausser

A.

Оптимизация секреторных путей целевых генов CO-продюсера.

Метаб. англ.

2017

;

40

:

69

–

79

.

48.

Скарчелли

Дж.Дж.

,

Шан

Т.К.

,

ISKRA

T.

,

ALLEN

M.J.

,

Zhang

L.

Стратегическое развертывание платформ CHO Expressions, чтобы доставить Pfizer Monoclonal Portfolio.

Биотехнология. прог.

2017

;

33

:

1463

–

1467

.

49.

Иннисс

М.К.

,

Бандара

К.

,

Джусиак

Б.

,

Лу

Т.К.

,

WEISS

R.

,

WROBLEWSKA

L.

,

Zhang

L.

Новая система интеграции BXB1 в Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette Cassette. Ячейки CHO

.

Биотехнология. биоинж.

2017

;

114

:

1837

–

1846

.

Примечания автора

Авторы желают, чтобы было известно, что, по их мнению, первые два автора должны рассматриваться как совместные Первые авторы.

© Автор(ы), 2018 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), которая разрешает некоммерческое повторное использование, распространение , а также воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. По вопросам коммерческого повторного использования обращайтесь по адресу [email protected]

© Автор(ы), 2018 г. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Субъект

Рекомбинация Целевая модификация генов

Раздел выдачи:

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

Скачать все слайды

Дополнительные данные

Дополнительные данные

Дополнительные данные — zip-файл

Реклама

Цитаты

Просмотры

16 849

Альтметрика

Дополнительная информация о метриках

Оповещения по электронной почте

Оповещение об активности статьи

Предварительные уведомления о статьях

Оповещение о новой проблеме

Оповещение о теме

Получайте эксклюзивные предложения и обновления от Oxford Academic

Ссылки на статьи по телефону

• Последний

• Самые читаемые

• Самые цитируемые

Регуляторная сеть, включающая микроРНК let-7 и SMUG1, связана с хорошим прогнозом при ER 9. 0339 + опухоли молочной железы

SIAh3 регулирует резекцию концов ДНК и восстановление репликационной вилки, способствуя убиквитинированию CtIP

Массивно-параллельный репортерный анализ выявляет сфокусированные и широко закодированные сигналы локализации РНК в нейронах

Модель репарации перекрестных связей ДНК с базовым сайтом; от архитектуры ДНК-связывающих доменов NEIL3 до модели X-структуры

Независимые от PRC2 действия h4.3K27M в дифференцировке эмбриональных стволовых клеток

Реклама

это что? Как работает мультилендинг

Эффективность лендингов достигается в первую очередь за счет их жесткой структуры и акцента на конкретном предложении. Одностраничный сайт не будет продавать несколько разных товаров или услуг, он вряд ли заменит полноценный интернет-магазин, и такой лендинг не всегда можно адаптировать под несколько категорий покупателей, ведь у каждого могут быть свои интересы, и можно выделить их все на одной странице, но придется расплачиваться легкостью восприятия информации, что плохо скажется на конверсии. Какой выход, если нужно достичь сразу нескольких целей? Сделать несколько целевых страниц? Можно, но дорого. Есть более изобретательный вариант – многопосадка.

Что такое мультилендинг

Мультилендинг — это когда контент динамический, то есть меняется в зависимости от того, какой посетитель на него пришел.

Что можно настроить пользователю на мультилендинг? Да что угодно:

• тексты
• предложения
• Контактная информация
• Изображения
• целые блоки и т.д.

Примеры, когда можно использовать мультилендинг

Вы занимаетесь услугами подбора автомобилей. Основные сегменты ваших пользователей: подборка автомобилей эконом-класса, автомобилей среднего и элитного класса. Если человек хочет дорогую машину, будет ли ему интересно смотреть на сайте фотографии бюджетных автомобилей отечественного производства? Нет, ему будут показывать фото дорогих автомобилей и предложение будет делать упор на элитный сегмент.

У вас несколько классов на курсах иностранного языка, которые расположены в разных частях большого города. Если человек, когда искал в Яндексе курсы по своему направлению, увидит слишком далекий от него адрес, то его даже не заинтересует ваше предложение. Если вы сразу, на главном экране, укажете ближайший к нему адрес, вероятность того, что он останется на странице, намного выше.

Вы украшаете дома и квартиры. Если вы ищете в контекстной рекламе, то в заголовке можно указывать только квартиры, а коттеджи вообще не упоминать. Наоборот.

Следует отметить, что возможность создания мультилендинга существует не всегда. Разрабатывать мультилендинг вам полностью не нужно , если:

• Вы не собираетесь гнать на него трафик с
• Ваша целевая аудитория однородна и нет смысла дробить ее на мелкие сегменты
• Товары или услуги, которые вы продаете на лендинге, очень близки друг к другу и все они могут быть полезны любому вашему посетителю.

Как сделать мультилендинг

Существует три основных способа создания динамического лендинга. Нельзя однозначно сказать, какой из них лучше или хуже, все зависит от конкретных целей лендинга.

1. Вставка скрипта. Вам необходимо вставить на сайт специальный скрипт, который будет менять контент в зависимости от запроса пользователя. Это делается путем общения с тегами UTM. Например, вы можете полностью вставить ключевой запрос в предложение.
2. Создание нескольких целевых страниц. Речь идет не о кардинально отличающихся друг от друга страницах, а о лендингах с минимальными изменениями. Типичный пример — страницы, разделенные на поддомены, ориентированные на разные города. Весь контент будет идентичным, но название и контактные данные будут другими.
3. Использование сервисов для создания мультилендингов. Есть ряд специальных сервисов, помогающих быстро и удобно делать мультилендинги (разумеется, не бесплатные), при этом они имеют разные полезные функции, значительно расширяющие ваши возможности. Пара вариантов таких услуг: Ягла или Ппц-помощь .

Прежде чем создавать мультилендинг, подумайте, насколько он вам нужен и что для этого может понадобиться. С одной стороны, вам может понадобиться помощь программиста, если вы захотите реализовать специальные скрипты, с другой стороны, вам нужно будет провести исследование аудитории и понять, насколько уместно использование динамического контента. Если вы уже провели исследование и знаете, как можно использовать мультиленды в своих целях, то делайте предложения для каждой группы посетителей и приступайте к тестированию!

Мультилендинг — это инструмент, который подстраивает контент сайта под поисковый запрос пользователя. Человек увидит на сайте именно те поисковые фразы, которые искал, а не общие фразы. Например, пользователь вводит в строку поиска ключевую фразу: «купить электрочайник» и видит платную рекламу с этой же фразой.

Нажав на одно из объявлений и попав на лендинг, он сразу видит, что здесь действительно продаются электрические чайники. Вероятность того, что он останется на этом сайте, чтобы найти чайник, очень высока. В этом примере ключевое слово присутствовало как в объявлении, так и на целевой странице.

Теперь рассмотрим нежелательный сценарий, когда ключевое слово содержится только в объявлении, а на лендинге общая фраза — чайники, а это могут быть все виды чайников. Человеку будет лень ходить по сайту в поисках нужного ему чайника, и, скорее всего, он закроет страницу. Такой лендинг будет иметь низкую конверсию и затраты на рекламу, скорее всего, не окупятся.

Это главное отличие лендинга от мультилендинга, в первой версии был реализован именно мультилендинг.

Можно наплодить кучу Html страниц, одна страница — одно ключевое слово — одно объявление. Этот метод прост, но занимает много времени. Поэтому переходим сразу ко второму способу, который требует программирования на PHP .

При создании рекламной кампании добавить ко всем ссылкам в объявлениях UTM -метки, среди которых обязательно должен быть параметр utm_term=(электрический_чайник ). В поля генератора Yaroshenko.by необходимые значения будет автоматически введено и будет сгенерирована ссылка с UTM -этикетки. Вместо (электрический_чайник) Яндекс Директ автоматически подставит «электрочайники».

Создана ссылка, ведущая на целевую страницу. Теперь нужно сделать саму посадочную страницу, наметить, где именно будет динамически меняться контент и с помощью PHP скрипт, который заменит нужные места в коде на разные ключевые слова.

Наша задача написать PHP скрипт, заменяющий в названии и описании общеупотребительные слова «чайник» на «электрический чайник» и «чайник со свистком». Страница должна иметь расширение .php , на странице Html PHP код не работает.

Простая HTML-разметка

Купить чайник

Как выбрать чайник?

Напишем переменную $ text , которая будет содержать слово «чайник». Код PHP всегда записывается в теге . $текст = «чайник»;
$ utm_term = $ _GET [«utm_term»];
if (! empty ($utm_term)) (
if ($utm_term == «электрический_чайник») (
$ text = «электрический чайник»;
}
if ($utm_term == «whistling_kettle») (
$ text=»whistling_kettle»;
}
}
?>

Преобразование статики в динамику

V Html находим в разметке все слова — «чайник» и заменить их на переменную $ текст . Эхо выводит на страницу переменную $ текст со словом чайник.И нам нужно вывести слово — электрический чайник.

Купить

Как выбрать?

&utm_term=(electric_kettle)

Создадим переменную с именем $utm_term , в нее подставим значение (electric_kettle) которое будет храниться в реферальном хвосте ссылки. GET -запрос работает, чтобы получить значение utm_term .

$ utm_term = $ _GET [«utm_term»];

Необходимо проверить, пустой параметр или нет. Проще говоря, этот скрипт будет работать у тех, кто перешел на лендинг по ссылке из UTM — остальные пользователи без тегов увидят базовую целевую страницу только со словом чайник.

If (!Empty($utm_term)) // создаем тестовое условие

Если значение параметра $utm_term не пусто, то делаем еще одну проверку. Если (если ) переменная $utm_term получила (двойное ==) ключевое слово из тега «electric_kettle» , то в переменную $ будет записан текст «электрический чайник».

If ($utm_term == «электрический_чайник»)
$ text = «электрический чайник»;

Это будет отображаться на странице, везде слово «чайник» будет заменено на «электрический чайник».

Аналогично будет работать скрипт для «чайника со свистком». Так происходит динамическая замена контента. Если пользователь зашел на сайт по ссылке с &utm_term=(electric_kettle) , то он увидит это ключевое слово в заголовке и описании.

Динамическая замена изображений

Помимо текста на мультилендингах можно менять картинки по тому же принципу. Вот сейчас в Html код показывает путь к картинке с чайником.

Добавим следующий PHP -код вместо названия картинки с чайником — чайник.jpg … Изменяем условие формирования тега img .

эхо $ utm_term;
) еще (эхо «чайник»;)?>. jpg «alt=»»>

Если UTM — метка пустая, то надо это предусмотреть и вывести общую картинку чайника — чайник.jpg .

Нужно проверить, если значение $utm_term не пусто (!пусто) , то выводим переменную $utm_term и далее узнаем название какого изображения должно отображаться на сайте.Например если получим из ярлыка &utm_term=(electric_kettle) , а это значит, что на сайте будет отображаться изображение электрочайника, нужно только назвать картинку — electric_kettle.jpg .

Возможно, вы слышали о последней новинке интернет-маркетинга – мультилендинге? А если нет, то у вас есть отличный шанс узнать об этом прямо сейчас.

Мультилендинг — это динамический лендинг. В отличие от простого лендинга, мультилендинг содержит адаптивный контент, меняющийся в зависимости от запросов потенциального клиента или его местонахождения.

Когда потенциальный клиент видит на мультилендинге информацию, максимально соответствующую его поисковому запросу, конверсия лендинга значительно возрастает по сравнению с обычным статическим лендингом.

Мультилендинг понадобится, если вы хотите вести несколько рекламных кампаний одновременно, использовать таргетированную рекламу, запускать одну рекламную кампанию на разные виды продаж.

Как повысить эффективность вашей целевой страницы?

Существует ряд технологий, которые могут значительно повысить коэффициент конверсии целевой страницы.

1) Геотаргетинг.
Технология заключается в том, что содержимое страницы автоматически изменяется в зависимости от географического положения посетителя. На странице может меняться все что угодно: фон, изображения, тексты или, как вариант, разные цены и акции для разных регионов.

Геотаргетинг — технология, при которой страница динамически изменяется в зависимости от географического положения пользователя

2) Мультилендинг (от англ. multilanding page)

При использовании этой технологии страница автоматически меняется в зависимости от того, какой поисковый запрос был использован для перехода на нее.

Проще говоря, на странице убирается все лишнее, а остаются предложения, товары и акции, подходящие под конкретный запрос клиента в поисковике.

Мультилендинг — динамическое изменение страницы в зависимости от поискового запроса

Таким образом, заказывая мультилендинг, вы получаете несколько сайтов в одном. Запросы целевой аудитории будут покрыты на 100%. А значит больше целевых действий — звонков и заявок, выше конверсия.

Почему стоит заказать мультилендинг у нас?

• Мы не делаем красивых картинок. Делаем продающие сайты.
• Вы получите готовую умную целевую страницу
• Наша система управления посадочной страницей поможет вам стать гуру интернет-маркетинга. Вы сможете оценить конверсию страницы, рассчитать эффективные каналы продаж. А если у вас нет времени, мы с радостью сделаем это за вас.
• Работаем честно и соблюдаем сроки. Ваши интересы защищены официальным договором.

Цена разработки мультилендинга

Простой мультилендинг	Мультилендинг + рекламная кампания	Премиум мультилендинг	Эксклюзивный мультилендинг
Студийный дизайн	Студийный дизайн		Индивидуальный дизайн премиум-класса
	Рекламная кампания для «Яндекс.Директ» или «Google AdWords» на выбор		Эксклюзивные фото и видео материалы, уникальные тексты
3-5 объявлений	10 объявлений		Рекламная кампания Яндекс.Директа
		Рекламная кампания для [email protected] и социальных сетей	Рекламная кампания для «Google AdWords»
		50 объявлений	Рекламная кампания для [email protected] и социальных сетей Из 50 объявлений
		Настройка воронки продаж	Разработка стратегии рекламной кампании, анализ целевой аудитории
			Настройка воронки продаж
От 15 000 руб.	От 30 000 руб.	От 50 000 руб.	От 90 000 руб.

В итоге вы получите

• мультилендинг, который реально работает;
• увеличение количества заявок и расширение клиентской базы;
• уникальный динамический контент, адаптированный к запросам вашего клиента;
• вся аналитика продаж: изменение конверсии по каждой странице, анализ эффективности каналов продаж, анализ входящих запросов по всем страницам мультиленда.

Остались вопросы?

как удивить пользователя, предложив ему то, что он ищет. Что такое мультилендинг

В этой статье мы рассмотрим инструмент, который будет изменять текст на сайте в зависимости от запроса пользователя. Мы будем делать так называемый мультилендинг, то есть замену текста на сайте, сервисом ЯГЛА.

Как работает сервис:

Например, если человек ввел в поиске фразу «Купить дом», а вы на сайте рекламируете квартиры, дома, участки и т. д., то это будет больше целесообразно этому человеку показывать страницу только с домами, так как ничего другого он не ищет. Если человек увидит на странице информацию о домах, то он скорее оставит заявку, чем если увидит квартиры. Подстановка текста на сайте, повышает конверсию сайта.

Пример:

Вот заголовок на моем сайте «Настройка и ведение контекстной рекламы»

Такой заголовок будет показываться всем, по какому бы запросу человек не пришел. Соответственно меня это не устраивает, и я буду делать подмену заголовка для каждого запроса.

Например, в моей кампании Яндекс Директ есть запрос «Настройка Яндекс Директ Краснодар».

Соответственно, если человек заходит на сайт по этому запросу, показывать ему стандартную рубрику о настройке контекстной рекламы будет не совсем рентабельно. На сайте лучше использовать подстановку текста, а заголовок написать более конверсионный. Как в примере ниже:

Это, конечно, не идеальное название, но я даю вам информацию в качестве примера. А затем дайте волю своему творчеству.

Главное, чтобы пользователю был дан точный ответ на его вопрос. В моем случае человек ищет услуги конкретно в Краснодаре, а мы ему просто показываем этот город и фразу.

Как настроить подмену текста на сайте

Первым делом регистрируемся в сервисе по ссылке ЯГЛА.

Если вы уже зарегистрированы, войдите на сайт, используя свое имя пользователя и пароль.

Вы увидите начальный интерфейс для настройки сервиса.

Нам нужно выбрать элементы для замены. Вы откроете страницу своего сайта в системе, и вам нужно нажать на элемент, который будет заменен. В качестве примера я покажу вам подмену только на заголовках, а дальше вы сможете модифицировать любой элемент на своем сайте, вплоть до логотипа. Когда элемент выбран, нажмите «Да, сделать его заменяемым».

Как работает подстановка текста в системе

Обратите внимание, что подстановки настраиваются только для групп объявлений. В моем примере объявление настроено со структурой 1 ключ = 1 объявление, поэтому я могу выполнить подстановку текста для всех ключей. Если у вас много ключей в одной группе, то вы можете сделать подстановку текста только для группы. Выход из этой ситуации такой: делать ключевые запросы в группе, похожей по названию (отражать одно и то же).

Вставьте заголовки в поле заголовка и нажмите Сохранить. Теперь подмена текста на сайте работает на вас. Осталось только установить код на сайт и запустить рекламу.

Если вы не совсем понимаете как сделать подмену текста на сайте (мультилендинг), то более подробно этот момент рассматриваю в видео:

Желаю удачи и нескончаемого потока лидов. С вами был Михаил Антонов. Свяжитесь со мной для настройки и оптимизации, а также для репоста статей!

Эффективность посадочных страниц достигается прежде всего за счет их жесткой структуры и акцента на конкретном предложении. Одностраничный сайт не будет продавать несколько разных товаров или услуг, он вряд ли заменит полноценный интернет-магазин, и такой лендинг не всегда можно адаптировать под несколько категорий покупателей, ведь у каждого могут быть свои интересы, а можно выделить их все на одной странице, но за легкость восприятия информации придется платить, что плохо скажется на конверсии. Какой выход, если нужно достичь сразу нескольких целей? Сделать несколько посадок? Можно, но дорого. Есть более изобретательный вариант – многопосадка.

Что такое мультилендинг

Мультилендинг — это контент на котором находится динамический, то есть меняется в зависимости от того, какой посетитель на него попал.

Что можно настроить пользователю на мультилендинге? Да, что угодно:

• тексты
• предложения
• Контактная информация
• Изображения
• целые блоки и т. д.

Примеры использования нескольких лендингов

Вы занимаетесь прокатом автомобилей. Основные сегменты ваших пользователей: выбор автомобилей эконом-класса, среднего и элитного класса. Если человек хочет дорогую машину, будет ли ему интересно увидеть на сайте фотографии бюджетных машин отечественного производства? Нет, ему будут показывать фото дорогих автомобилей и предложение будет делать упор на элитный сегмент.

У вас есть несколько классов на курсах иностранных языков, которые расположены в разных частях большого города. Если человек при поиске курсов в Яндексе в своем районе увидит слишком далекий от него адрес, то его даже не заинтересует ваше предложение. Если вы сразу, на главном экране, укажете ближайший к нему адрес, вероятность того, что он задержится на странице, намного выше.

Вы занимаетесь отделкой домов и квартир. Если вы ищете контекстную рекламу, то в заголовке можно указывать только квартиры, вообще не упоминая коттеджи. Наоборот.

Следует отметить, что целесообразность создания мультилендинга существует не всегда. Разработать мультилендинг вам полностью не надо , если:

• Вы не собираетесь гнать на него трафик с
• Ваша целевая аудитория однородна и нет смысла дробить ее на мелкие сегменты
• Товары или услуги которые которые вы продаете на лендинге, очень близки друг к другу и все они могут быть полезны любому из ваших посетителей.

Как сделать мультилендинг

Есть три основных способа создания динамического лендинга. Нельзя однозначно сказать, какой из них лучше или хуже, все зависит от конкретных целей десанта.

1. Вставка скрипта. Вам необходимо вставить на сайт специальный скрипт, который будет менять контент в зависимости от запроса пользователя. Это делается путем связывания с тегами UTM. Например, вы можете полностью вставить ключевой запрос в предложение.
2. Создание нескольких лендингов. Речь идет не о страницах, кардинально отличающихся друг от друга, а о лендингах с минимальными изменениями. Типичный пример — страницы, разнесенные по субдоменам, с таргетингом на разные города. Весь контент будет идентичным, но название и контактные данные будут другими.
3. Использование сервисов для создания мультилендингов. Есть ряд специальных сервисов, которые помогают быстро и удобно создавать мультилендинги (разумеется, не бесплатно), при этом они имеют разные полезные функции, значительно расширяющие ваши возможности. Пара вариантов обслуживания: Ягла или КПП-помощь .

Прежде чем создавать мультилендинг, подумайте, насколько он вам нужен, и что для этого может понадобиться. С одной стороны, вам может понадобиться помощь программиста, если вы захотите реализовать специальные скрипты, с другой стороны, вам нужно будет провести исследование аудитории и понять, насколько уместно использование динамического контента. Если вы уже провели исследование и знаете, как можно использовать мультиленды в своих целях, то вносите предложения для каждой группы посетителей и приступайте к тестированию!

Мультилендинги «гуляют» в ведущих трендах интернет-маркетинга уже около 5 лет. Однако единого толкования того, что это такое, не существует. Существует несколько подходов с разными принципами действия и разными эффектами.

В этой статье вы узнаете о технологии адаптивного контента. Это подгонка заголовка, подзаголовка, текста в лид-форме под запросы пользователей на той же странице. В чем преимущества мультилендинга с адаптивным контентом по сравнению с другими методами?

Персонализированный маркетинг

Во-первых, давайте вспомним, как все начиналось. На Западе о персонализации и актуальности говорили еще 5-6 лет назад. Явный эффект был замечен в электронном маркетинге. а отправка каждой группы целевых сообщений приносила рост открываемости (открытых писем) и кликрейта (переходов по ссылкам) не менее чем на 75-80%.

Для квалификации абонентов стали внедряться сложные скрипты. Однако цена того стоила. Эффективность контента «один за всех» чем дальше, тем больше стремилась к нулю.

Следующим шагом стал геотаргетинг на веб-ресурсы. Методика особенно эффективна для интернет-магазинов и крупных брендов с сетью филиалов. Город определяется автоматически по IP-адресу, и посетитель видит, например, рубрику «продажа камер GoPro в Екатеринбурге».

Известный эксперт в области электронной коммерции Нил Патель получил на 68 % больше лидов благодаря геотаргетингу на своем сервисе Quicksprout.com.

Правило точного соответствия

В контекстной рекламе клики мотивируются привлекательной рекламой. Но если человек кликнул, например, на «снегоходы в Рязани со скидкой 15%», а попал на главную компанию по продаже мотоциклов, то даже суперреклама будет «мимо кассы».

Точное соответствие запроса тому, что пользователь видит на целевой странице, увеличивает его конверсию. Это принцип релевантности. На самом деле обычная психология: мы более лояльны к тому, что как-то связано с нами.

Служба A/B-тестирования Оптимизация увеличила конверсию на 39% после создания 3 целевых страниц для 3 разных объявлений в Google.

Вариант 1. Все объявления ведут на одну и ту же страницу:

Вариант 2. Каждое объявление ведет на отдельную страницу

По сути, это многократное дублирование одного шаблона с разными заголовками под разными URL. И тут возникает ряд вопросов:

• Страницы создаются на специальной платформе. Что делать тем, у кого уже есть сайт на другой CMS?
• Нужно ли создавать сотни страниц для каждого объявления?
• Как синхронизировать подмены с рекламной кампанией в Яндекс.Директе?
• Как протестировать и сравнить эффективность всех вариантов?

Посмотрим, как их решает сервис адаптивного контента «Ягла».

Мультилендинг с адаптивным контентом

Вместо сотни дубликатов гораздо удобнее настроить автоматическую подстановку заголовка, подзаголовка, подписи в форме захвата и части изображений на одной странице. Контент меняется в зависимости от запроса пользователя.

В одну и ту же службу звонят по-разному:

Запрос « Продвижение сайта »

Request « Increasing site traffic »

The product has different use cases, packaging or purchase conditions:

Request « Plastic windows to the country house »

Заявка « Установка металлопластиковых окон »

Привет всем. Недавно я написал статью о том, как подать заявку на целевую страницу. По сути, мы получали UTM-данные из адресной строки, сохраняли их в скрытых полях и передавали обработчику, как и данные из обычных полей.

Аналогичным образом можно менять контент на странице в зависимости от того, по какой фразе к нам пришел посетитель. Сейчас сайт с такой функцией называется мультилендингом, и сегодня мы разберем php скрипт, который поможет нам реализовать такой функционал на нашем лендинге.

Давайте, наконец, разберемся, как сделать мультилендинг самостоятельно, без использования сторонних сервисов, за которые нужно платить деньги. Кстати, если надумаете внедрять, поделитесь пожалуйста результатами конвертации позже. Буду очень признателен за скриншоты в духе «До/После» и если хотите, мы опубликуем скриншот вместе со ссылкой на ваш лендинг в конце статьи как доказательство работоспособности инструмента. Думаю, это будет только плюсом для вашего проекта (лишняя естественная ссылка).

Итак, для работы нам нужен php, а значит при необходимости нужно переименовать вашу главную страницу с index.html на index.php. Это никак не повлияет на выполнение посадки.

А теперь давайте поставим перед собой задачу. Допустим, я хочу, чтобы заголовок моей целевой страницы менялся в зависимости от запроса. Например, я подобрал следующие запросы:

• Макет лендинга
• Разработка целевой страницы

И я хочу, чтобы пользователи видели наиболее релевантный заголовок, когда они нажимают на определенный запрос. Давайте создадим ссылку для каждого запроса с расширением . Мы остановимся на параметре «utm_content» (вы можете выбрать любой).

Итак, для запроса «» — utm_content=создание, для «Верстка лендинга» — utm_content=верстка, а для «Разработка лендинга» — utm_content=разработка.

Теперь приведу сам php скрипт:

Как видите, запросом _Get мы ловим нужные нам данные (utm_content или любой другой интересующий нас параметр), а дальше следует элементарное условие. Если значение параметра «создать», то сохраняем в переменную текст «Создание лендинга» и выводим его в нужном месте таким образом:

Если ни одно из условий не сработало, то выводим значение по умолчанию:

Else( $multiTitle = «(!LANG: Landing page blog»; } !}

Для того, чтобы вам было проще разобраться, я подготовил исходник, в котором проставил ссылки с меткой utm. Таким образом, вы можете легко увидеть, как это работает.

Вот вышла статья. Спасибо за идею. Я думал, что самому сделать мультилендинг очень сложно и так и не решился разобраться в этой теме.

Некоторые ребята даже предлагали сделать кучу разных страниц с разным содержанием и давать разные ссылки в зависимости от запроса. Но это слишком раздражает. Итак, вот вам источник. Используйте 🙂 кроме того, вы можете менять не только текст, но и картинки, и другие виды контента. А на сегодня — все! Буду признателен за ретвит. Всем пока!

Многоцелевые шасси | Научный.Нет

Журналы

Книги

Журналы

Инженерные исследования

Форум передовых инженеров

Прикладная механика и материалы

Инженерные инновации

Журнал биомиметики, биоматериалов и биомедицинской инженерии

Международный журнал инженерных исследований в Африке

Материаловедение

Расширенные исследования материалов

Форум по дефектам и диффузии

Применение диффузионных фундаментов и материалов

Журнал метастабильных и нанокристаллических материалов

Журнал нано исследований

Ключевые инженерные материалы

Форум материаловедения

Наногибриды и композиты

Твердотельные явления

Инженерная серия

Достижения в области науки и техники

Строительные технологии и архитектура

Материаловедение

Строительные материалы

Общее машиностроение

Машиностроение

Биологические науки и медицина

Производство

Электроника

Строительство

Гражданское строительство

Механика

Нанонаука

Компьютеры

Информационные технологии

Транспорт

Промышленная инженерия

Инженерия окружающей среды

Специальные книжные коллекции

Основы материаловедения и инженерии

Коллекция научных книг

Специализированные коллекции

Ретроспективная коллекция

Главная Многоцелевые шасси

Заголовок статьиСтраница

Разработка системы анализа поведения при посадке и рулении самолетов с многоколесными и многопосадочными шасси

Аннотация: На основе модульной концепции разработана система анализа поведения при посадке и рулении самолетов с многоколесными и многостоечными шасси. Во-первых, подмодели, такие как модель масляного столба, модель буфера, модель шины и модель шасси, должны быть построены одна за другой; затем модель фюзеляжа может быть собрана из подмоделей; наконец, при заданных начальных условиях можно рассчитать реакцию самолета на посадку и руление. Модель самолета с несколькими колесами и несколькими шасси была взята в качестве примера для проверки осуществимости и эффективности программного обеспечения.

511

podesttreppe — Перевод на русский — примеры немецкий

Эти примеры могут содержать нецензурные слова, основанные на вашем поиске.

Эти примеры могут содержать разговорные слова на основе вашего поиска.

Das Dachgeschoss wird über die Podesttreppe erschlossen.

Доступ на чердак осуществляется через лестница-платформа .

Алюминий Podesttreppe für das sichere Erreichen von Zwischenböden, -türen. о.а.

Алюминиевые лестницы платформы для безопасного доступа к промежуточным этажам, дверям и подобным областям

Podesttreppe mit 45º Treppenneigung bis zu einer maximalen senkrechten Höhe von 4.080mm.

Платформенная лестница с углом наклона 45º и максимальной вертикальной высотой 4080 мм.

Ermöglicht das Verschieben des Drehpunkts einer Podesttreppe .

Позволяет перемещать точку поворота лестницы с несколькими посадочными площадками .

Mit dem von uns entwickelten Bowdenzugsystem werden die Podestreppen Typen 51502 + 51602 ungewohnt fahrbar und sicher: Die Zugwirkung des Hebels hebt die Aluminium Podesttreppe in die fahrbereite Position und stellt beim Loslassen sofort den festen Stand auf allen vier Holmen her.

Благодаря разработанной нами тросовой системе Боудена лестницы-платформы типов 51502 + 51602 очень мобильны и безопасны: рычаг поднимает алюминиевую лестницу-платформу в ее мобильное положение, а затем сразу же фиксирует все четыре боковых поручня, когда вы отпускаете их.

Умереть Podesttreppe KRAUSE mit Geländer und Rollen besteht aus langlebigem Aluminium.

Лестница-платформа KRAUSE с перилами и роликами изготовлена ​​из прочного алюминия.

Für noch mehr Sicherheit ist an der Podesttreppe einseitig ein Handlauf angebracht.

Для еще большей безопасности к 9 крепится поручень.0213 подиум лестницы с одной стороны.

Einseitig begehbare, gebrauchte Podesttreppe или алюминий.

Односторонняя проходная, бывшая в употреблении лестница-подиум из алюминия.

Die Podesttreppe mit 2 Lenkrädern hat einen Neigungswinkel von 60 Grad.

Стремянка-платформа промышленная с 2-мя колесами имеет угол наклона 60 градусов.

Die Podesttreppe ist mit 2 oder 4 Lenkrädern erhältlich. +

Промышленная стремянка-платформа доступна с 2 или 4 колесами. +

Podesttreppe mit beidseitigem Handlauf und Geländer,

Ступени платформы с двусторонними поручнями и перилами,

Die Podesttreppe ist mit 2 oder 4 Lenkrädern erhältlich.

передвижной и доступный с 2 ​​или 4 колесами

Podesttreppe Modulare Treppe für das Lager oder die Wartung von Maschinen

Модульная стремянка для склада или обслуживания техники

Die Innenkulisse erweckt den Eindruck, dass das erste Obergeschoss über die zweiläufige Podesttreppe zu erreichen ist.

Набор также создает иллюзию того, что на второй этаж можно подняться по двум лестничным маршам с лестничной площадкой между ними.

Die HUF Treppenanlage, als Podesttreppe oder einläufige Treppenanlage, besteht aus Wangen, eingestemmten Treppenstufen und einem Geländer mit abgerundetem Handlauf aus Leimholz.

Лестница HUF, , спроектированная как одинарная или платформа , состоит из косоуров, врезных ступеней и перил с закругленными перилами из клееного бруса.

Eine Podesttreppe ist eine Treppe, die von einemo oder mehreren Podesten unterbrochen wird.

Лестница с изгибом — это лестница, прерываемая одной или несколькими площадками.

Heute ist nur noch das Erdgeschoss erhalten, zu dem sich der Eingang an der Nordostecke befindet, sowie das Fundament einer Podesttreppe .

Единственная оставшаяся часть — это подвал, вход в который находится в северо-восточном углу, и основание главной лестницы .

Auf dersuche nach einer Leiter, Podesttreppe oder einer Steigleiter mit Korb für die Industrie?

Ищете стремянку, стремянку с площадкой , стремянку с площадкой или лестницу с каркасом для промышленного сектора?

In der Industrie und im Handwerk finden Aluminiumtreppen vielfach Anwendung als Podesttreppe , Übergang oder Wartungsbühne.

В промышленности и торговле алюминиевые ступени довольно часто используются в качестве площадок ступеней , проходов или площадок обслуживания.

Schwerlastregalanlage mit Podesttreppe Lagertechnik Tipp

Система стеллажей для тяжелых условий эксплуатации с лестницей-площадкой Наконечник по технологии хранения

Возможно неприемлемый контент

Примеры используются только для того, чтобы помочь вам перевести искомое слово или выражение в различных контекстах. Они не отбираются и не проверяются нами и могут содержать неприемлемые термины или идеи. Пожалуйста, сообщайте о примерах, которые нужно отредактировать или не отображать. Грубые или разговорные переводы обычно выделены красным или оранжевым цветом.

Зарегистрируйтесь, чтобы увидеть больше примеров Это простой и бесплатный

регистр Соединять

Поход с видом на Эверест | Трекинг с видом на Эверест Multiland | Everest View Trekking

Mountain Mart Trek предлагает вам дополнительную карту маршрута и футболку

Что взять с собой

Это очень активное путешествие, а это означает, что вы будете в движении большую часть времени, поэтому собирайте вещи как можно легче. Мы предоставляем одного носильщика на каждые два путешественника; ваше треккинговое снаряжение будет нести носильщик в спортивной сумке, которую мы предоставим. Носильщикам разрешено нести не более 15 кг на треккера, что означает 30 кг с 2 треккеров. Ненужный багаж можно оставить в отеле Катманду совершенно бесплатно. .

Важное примечание:

Пожалуйста, ознакомьтесь с разделом Контрольный список этих заметок о путешествии для получения дополнительной информации о том, что вам нужно взять с собой в поход в этой поездке. Вам нужно будет взять с собой удобный дневной рюкзак среднего размера, чтобы носить с собой вещи, которые вам понадобятся в течение дня. У него должен быть поясной ремень или (лучше) мягкий поясной ремень. Погода может меняться на большой высоте, поэтому в течение всего года рекомендуется носить многослойную одежду.

Пожалуйста, внимательно прочитайте «Правила и условия» MMT перед бронированием поездки

Треккинг или альпинизм на высокогорных высотах Гималаев — одно из самых авантюрных занятий, которое влечет за собой риск AMS, травм или даже смерти. MMT всегда заботится о комфорте, безопасности и здоровье путешественников, блуждающих по большой высоте. Мы прилагаем большие усилия для снижения или контроля рисков и опасностей; но иногда проклятие природы или колебания климата в Гималаях находятся вне нашего контроля, и мы не несем за это ответственности.
Если вы являетесь страстным любителем приключений и готовы следовать настоящим Правилам и условиям, добро пожаловать в офис ММТ,  Калдхара-марг, Пакнаджол, Тамель, Катманду, Непал.

УСЛОВИЯ БРОНИРОВАНИЯ:

1. Все заказы пакетов осуществляются через Mountain Mart Treks and Expedition, которая является авторизованной приключенческой компанией, базирующейся в столице Непала: Катманду.

2. Термин «поездка» формально относится к прогулкам, осмотру достопримечательностей, походам, турам, альпинизму, экспедициям или отдыху в мистической стране, Непале.
3. ММТ добросовестно предлагает все удобства в расчетной цене пакета.
4. Пожалуйста, перейдите на страницу маршрута или страницу включения трека для получения подробной информации о прозрачности затрат. Стоимость похода может варьироваться от одного пакета к другому, и некоторые пакеты не включают стоимость следующего:

• Личное страхование путешествий, медицинская помощь и эвакуация на вертолете.
• Расходы на визу, паспорт и транзитные пункты.
•  Дополнительное питание, развлекательные мероприятия, проживание, транспортные расходы в маршрут не входят.
• Прачечная, почта, лекарства, одежда, снаряжение и личные расходы.
• Чаевые и оплата сверхнормативного багажа.

 5. Путешественники должны заплатить 20%  авансом от общей стоимости поездки за подтверждение поездки.
6. Вы можете оплатить сумму подтверждения бронирования кредитной картой или банковским переводом, оба варианта оплаты подлежат взиманию дополнительных банковских комиссий до 4% сверх суммы.
7. Поездка будет забронирована после оплаты путешественниками. Мы отправим вам подтверждающее письмо через Интернет и обеспечим все детали обслуживания, указанные в маршруте.
8. Окончательная оплата должна быть произведена в офисе ММТ до отправления чаевых. В противном случае вы не будете иметь права на поездку, и никакие окончательные документы не будут раскрыты до оплаты.
09. Что касается отмены поездки, мы предоставляем бесплатную услугу отмены поездки при предоставлении достоверных причин до 90 дней до даты отъезда при наличии достаточных доказательств и письменных причин.
10. Если вы отмените поездку за 60 дней до даты отъезда, то с суммы бронирования будет взиматься плата за отмену в размере 75%.
11. Плата за отмену в размере 85% взимается, если вы отменяете поездку до 30 дней до даты отправления.
12. Компания не сможет вернуть ранее оплаченный (20%) платеж за бронирование, если вы отмените поход до 15 дней до даты отъезда.
13. Плата не возвращается, если вы добровольно покидаете или отменяете поездку после ее начала; но если вы вынуждены уйти из-за непредвиденных непосредственных обстоятельств, оплата может быть возвращена по собственному усмотрению.
14. Мы гарантируем вашу безопасную и успешную поездку; однако компания оставляет за собой право отменить поездку, если не будет минимального количества (2) путешественников. В этом случае компания отложит или организует альтернативную поездку.
15. Если компания отменяет поездку из-за каких-либо непредвиденных обстоятельств, которые находятся вне нашего контроля (например, стихийное бедствие, отмена рейса, забастовки, войны, беспорядки, карантин, политика государственного вмешательства, погодные условия), мы вернем деньги за вычетом минимальной операционной вовлеченная стоимость.
16. Если вы хотите изменить дату бронирования, запрос на изменение бронирования должен быть сделан за 90 дней до отправления первоначальной поездки.
17. Если туристы потребуют изменить дату отъезда до 60 дней до окончательного отъезда, взимается плата в размере 50 долларов США с человека в качестве сбора за отмену. Плата за поездку также может быть увеличена, если рыночная цена взлетит выше во время отложенной даты поездки.
18. Политика нашей компании такова: Треккеры должны иметь страховой полис, если они хотят путешествовать с ММТ. В полисе должны быть указаны: медицинское страхование, скорая помощь, возможность эвакуации вертолетом, а также, если возможно, страхование отмены рейса.
19. Mountain Mart Treks and Expedition организует различные авантюрные походы, которые сопряжены с высоким фактором риска и требуют большей физической выносливости и подготовки. Если вы не можете совершить поход из-за своей физической недееспособности или болезни, мы не обязаны возвращать оплату.
20. Во время поездки могут возникнуть помехи, препятствия или обстоятельства, такие как: политический бунт, мятеж, несчастный случай, изменение климата или стихийные бедствия. Убедитесь, что вы готовы справиться со всеми этими проблемами.
21. Маршрут поездки, размещение, виды транспорта могут быть изменены без предварительного уведомления в связи с непредвиденными обстоятельствами. Это сделано для вашего удобства и безопасности, поэтому надеемся, что в этом контексте вы проявите гибкую человеческую натуру.
22. При изменении маршрута, транспорта, проживания или маршрута из-за вышеуказанных обстоятельств мы можем взимать дополнительную плату или уменьшать стоимость в соответствии с общими расходами на весь поход.
23. MMT обладает всеми полномочиями отклонять, принимать, задерживать или удерживать любых участников поездки, если мы обнаружим кого-либо подозрительного или недисциплинированного. Если вы хотите отправиться в поход с ММТ, вы должны принять наше руководство на протяжении всего путешествия.
24. ММТ заключила контракты с сетью компаний, правительством Непала, частными лицами для оказания помощи путешественникам во время поездки. Эти третьи стороны имеют право выполнять свои обязанности в соответствии с договором. Мы не несем ответственности в случае утери, повреждения, нарушений, если третьи лица не выполняют свои обязанности должным образом.
25. ММТ не несет ответственности за нарушение каких-либо законов или правил, совершенное путешественниками в любой стране.
26. Настоящее соглашение регулируется законами правительства Непала. Никакое физическое лицо: сотрудники, представители, руководство компании не могут изменять условия.
27. От этих условий можно отказаться только при особых обстоятельствах с письменным заявлением директору. Только директор компании имеет право вносить в них изменения.
28. Путешественники должны быть физически и психически готовы к походу. Обязательно принести справки о состоянии здоровья вместе с соответствующими юридическими документами для утверждения поездки, если это необходимо.
29. Если рейс отменяется или задерживается из-за климатических изменений или по другим причинам, ММТ не несет ответственности за дополнительные расходы или компенсацию. Мы можем организовать альтернативное расположение по специальному запросу, который может потребовать дополнительных затрат.
30. Мы разместили достоверную, подлинную и точную информацию на нашем официальном сайте и в брошюре. Если вы заметили какую-либо ошибку, неполную или неправильную информацию, пожалуйста, сообщите нам вовремя.
31. Пожалуйста, прочтите все вышеупомянутые «Условия и положения»  перед бронированием. Вы должны соблюдать эти условия, если хотите отправиться в поход в Гималаи с Mountain Mart Treks (MMT)

Иностранцы, не являющиеся гражданами Индии, которые намереваются посетить Непал, должны иметь действующий паспорт до подачи заявления на получение непальской визы. Паспорт должен быть действителен в течение шести месяцев с даты прибытия. Иностранцы могут получить непальскую визу по прибытии в аэропорт Катманду или в пограничном иммиграционном офисе. Для подачи заявления на получение туристической визы в Непал требуется одна недавняя копия цветной фотографии паспортного размера. Mountain Mart Trek перечислил советы по получению визы в Непал для путешественников в Непал.

Туристические визы выдаются на срок не более 150 дней в визовом году (с января по декабрь)

Иностранец, выехавший до истечения срока, указанного в визе, выданной в визовый год, не может использовать визу, добавив оставшийся срок к другому году визы. Если какой-либо иностранец, въехавший в Непал ближе к концу визового года, желает продлить свое пребывание на новый визовый год, он может сделать это, купив еще одну визу на Новый год. При условии, однако, что расчет сборов за такой период производится на основе общего периода пребывания.

Заявление на получение туристической визы должно быть подано в формате, указанном в Приложении 1.

Непальская виза, выданная за границей, действительна для въезда в течение трех-шести месяцев с даты выдачи. True —

Исключения для туристической визы

Граждане следующих стран должны получить визу в своей стране в посольстве и консульстве Непала.

Афганистан, Камерун, Эфиопия, Гана, Ирак, Либерия, Нигерия, Палестина, Сомали, Зимбабве.

Запись

Иностранцы, кроме индийцев, не имеют права на въезд в Непал без действующей визы.

Визы можно получить в следующих иммиграционных службах Непала:

• Международный аэропорт Трибхуван, Катманду
• Какарвитта, Джхапа (Восточный Непал)
• Биргандж, Парса (Центральный Непал)
• Кодари, Синдхупалчоук (северная граница)
• Белхия, Бхайрахава (Рупандехи, Западный Непал)
• Джамуна, Непалгандж (Банк, Средний Запад Непала)
• Мохана, Дхангади (Кайлали, Дальний Запад Непала)
• Гаддачауки, Махендранагар (Канчанпур, Дальний Запад Непала)

Бланки заявлений на получение визы

Копия бланка заявления на получение визы доступна для использования в конце этого документа, что позволяет избежать длинной очереди для получения бланка на получение визы в Непал в международном аэропорту.

Визовые сборы

Сборы, уплачиваемые только в долларах США за получение визы по прибытии на любой границе, следующие:

1. Туристическая многократная виза на 15 дней: 25 долларов США, оплата только в долларах США.
2. Туристическая многократная виза на 30 дней: 40 долларов США, оплата только в долларах США
3. Туристическая многократная виза на 90 дней: 100 долларов США, оплата только в долларах США
4. Независимо от положений, указанных в пунктах E1 и E2 выше: Туристы с паспортами из Южной Азии
   Страны Ассоциации регионального сотрудничества (СААРК) (Бангладеш, Бутан, Индия, Мальдивы, Пакистан
   и Шри-Ланка) не обязаны платить консульский сбор за 30-дневную визу.
5. гражданам Индии не требуется виза для въезда в Непал.

Сборы за продление визы

Сборы (только в местной непальской валюте) за продление срока пребывания или продление визы:

1. Эквивалент 2 долларов США в непальской валюте за день периода продления .
2. Дополнительные 20 долларов США или эквивалент в непальской валюте подлежат уплате за однократную визу в F1, если запрашивается услуга многократного въезда на продленный период.
3. Если иностранные посетители не смогли продлить свою визу и должны сделать это в пункте выезда, они должны заплатить дополнительно эквивалент 3 долларов США в непальской валюте в рамках обычного сбора за продление визы.
4. Иностранные посетители, которые просрочили срок действия визы в 150 дней без продления, должны оплатить дополнительный визовый сбор в соответствии с положением F3, а также штраф, как указано в пункте 10 вс-пункт 4 Закона об иммиграции 2049.
5. Независимо от положения, указанного в F1: 15 дней считаются минимальным периодом продления, и визовый сбор взимается соответственно. При продлении более чем на 15 дней визовый сбор взимается в соответствии с положением F1.
6. Туристическая виза может быть продлена на срок до 150 дней в течение одного визового года (январь-декабрь).
   Дешевле приобрести 30-дневную визу в пункте въезда, а затем продлить ее на 15 или более дней в центральном иммиграционном офисе в Катманду или Покхаре, если вы не находитесь в течение 90 дней или более

   Для продления визы вам понадобятся две дополнительные фотографии на паспорт для каждого расширения.

Транзитная виза

Транзитная виза на один день может быть получена в иммиграционных службах Непала в пункте въезда после предъявления билета на вылет через международный аэропорт Трибхуван в Катманду. Плата составляет 5 долларов США или эквивалент в конвертируемой валюте. Транзитная виза не может быть продлена.

Непальскую визу можно получить в посольстве/консульстве Непала в вашей стране или по прибытии в аэропорт Катманду. Также возможно получить визу в других пограничных пунктах въезда. Вам понадобится 1 фото на паспорт каждый раз.

Для иностранных инвесторов деловую визу с возможностью многократного въезда сроком на один год или пять лет можно получить в Департаменте иммиграции по рекомендации Министерства промышленности и торговли, заплатив 100 долларов США и 250 долларов США. или эквивалентная конвертируемая иностранная или непальская валюта.

Примечание : Хотя мы стараемся сделать информацию, содержащуюся здесь, максимально точной, мы не несем ответственности за любые потери, сбои или неудобства, понесенные кем-либо, использующим эту информацию.

Важная информация для посетителей

Иностранных посетителей просят записывать даты в непальской визе и номер паспорта, чтобы избежать возможных проблем. На продление визы необходимо подавать заявление в течение срока действия непальской визы.

Просим вас убедиться, что вы получили штампы о прибытии/отбытии в вашем паспорте на пунктах въезда/выезда, чтобы избежать возможных юридических осложнений.

Проживание в Непале без паспорта или действующей визы является наказуемым правонарушением.

Отклонение от предписанных маршрутов походов, указанных в вашем разрешении на треккинг, будет рассматриваться как нарушение закона.

Во избежание юридических осложнений рекомендуется опасаться посредников/мошенников и поддельных документов или виз/разрешений на треккинг.

Изменение цели вашего пребывания без разрешения не допускается, а трудоустройство или волонтерская деятельность во время действия туристической визы строго запрещены. Это будет наказуемое деяние.

Обязательно зарегистрируйтесь на контрольно-пропускных пунктах полиции и иммиграционной службы на любом маршруте. Было бы разумно зарегистрировать пункт назначения и расписание похода в вашем посольстве или консульстве.

Если у вас возникнут проблемы на тропах, немедленно сообщите об этом в ближайшую полицию или иммиграционную службу.

Просим вас обменивать деньги у официальных дилеров и не забывайте брать и сохранять формальные квитанции.

Вас просят информировать сотрудников иммиграционной службы или полицейского участка о любых изменениях адреса, ранее указанного в вашей анкете на получение визы или в карточке о высадке, в течение семи дней.

Если ваше пребывание в качестве туриста составляет более 120 дней в течение одного визового года, и вы хотите посетить дополнительные места более чем на 24 часа, вы должны зарегистрироваться в местном отделении полиции таких мест, указав свое имя, номер паспорта и адрес.

Вам рекомендуется связаться с Департаментом иммиграции, чтобы запросить перенос визы в случае получения нового паспорта или проездного документа в вашем посольстве, и в течение семи дней.

Паспорт и разрешение на треккинг должны быть у каждого туриста во время трекинга.

Съемка в зонах с ограниченным доступом или в зонах с ограниченным доступом без разрешения строго запрещена.

Пожалуйста, не вынимайте визовые наклейки из своего паспорта и не пытайтесь изменить записи, отпечатанные в вашем паспорте.

Мы просим вашего содействия в соблюдении следующих правил во время вашего пребывания в Непале. Уважайте местные традиции, обычаи, ценности и чувства, помогайте защищать местную культуру и поддерживать местную гордость.

1. Уважайте частную жизнь во время фотосъемки.
2. Почитай святые места.
3. Воздержитесь от раздачи денег детям, так как это будет способствовать попрошайничеству.
4. Соблюдение местного этикета принесет вам уважение.
   Позвольте Гималаям изменить вас — не меняйте их: так что помните, пока вы в походе:
5. Оставьте кемпинги чище, чем вы их нашли.
6. Не разжигайте открытый огонь.
7. Сожгите сухие бумаги и пакеты в безопасном месте.
8. Поддерживайте чистоту местной воды и избегайте использования загрязняющих веществ.
9. Растения должны расти в естественной среде.
10. Помогите своим гидам и носильщикам соблюдать меры по сохранению.
11. Защита окружающей среды.

Информация для граждан Индии

Гражданам Индии разрешено путешествовать по Непалу при наличии одного из следующих документов:

Паспорт; Водительское удостоверение с фотографией; Удостоверение личности с фотографией, выданное государственным органом; Карточка с фотографией; Удостоверение избирателя с фотографией; Свидетельство о регистрации, выданное посольством Индии гражданам Индии, проживающим в Непале; Специальные / временные удостоверения личности, выдаваемые посольством Индии гражданину Индии в случае крайней необходимости; Документ с фотографией и указанием личности, выданный магистратом или вышестоящим органом.

Общая информация

Департамент иммиграции Каликастан, Диллибазар, Катманду.
Тел.:	977 — 01 — 4433934 / 4429660 / 4438862 / 4438868
Факс:	977 — 01 — 4433935
Электронная почта:	[email protected]
Интернет:	http://nepalimmigration.gov.np/

Часы работы

С воскресенья по четверг	10:30 — 17:00 летом
	10:30 — 16:00 зимой (с ноября по январь)
Пятница	10:30-15:00

Время подачи заявлений на получение визы

С воскресенья по четверг	10:30 — 15:00
Пятница	10:30 — 13:00

Примечание : Вся приведенная выше информация основана на информации из офиса Департамента иммиграции Непала и может быть найдена на их веб-сайте.

Треккинговые карты и разрешения для заповедных зон, национальных парков и заповедных зон

Все туристы должны иметь при себе карточку Системы управления информацией для треккеров   (карта TIMS) . Его можно получить в Центре туристических услуг в Катманду: с воскресенья по пятницу с 10:00 до 13:00 и с 14:00 до 17:00. Это бесплатно, но требуется две фотографии на паспорт. (Турагентства предоставляют карты своим клиентам.) Покажите их на контрольно-пропускных пунктах на маршрутах.

Разрешение на треккинг требуется для всех походов, проходящих через заповедники или национальные парки.

Разрешение на посещение заповедной зоны можно приобрести в Центре туристических услуг за 2000 рупий плюс две фотографии.

Входные билеты в национальный парк стоят 3000 рупий и не требуют фотографии. Приобрести можно только в офисе Департамента национальных парков и охраны дикой природы с воскресенья по пятницу с 09:00 до 14:00 (рядом с офисом туристических услуг).

Разрешения на территорию с ограниченным доступом  требуются в основном для походов в кемпинге в отдаленных районах недалеко от тибетской границы, для чего настоятельно рекомендуется сопровождение гида. Их можно приобрести только для двух или более треккеров. Разрешения выдаются Центральным иммиграционным управлением, требуют два рабочих дня, ваши оригиналы паспортов (не факсимиле) и две фотографии. Стоимость варьируется от 10 долларов США в неделю до 500 долларов США за 10 дней плюс существенные дополнительные суммы за каждый дополнительный день. Их приобретет выбранное вами туристическое агентство. Офисы открыты ежедневно, но по субботам часы работы ограничены.

Туристическая виза

Иностранный турист, посещающий Непал, должен получить туристическую визу.

Туристическая виза выдается на срок не более 150 дней в визовом году (Годы визы означают с января по декабрь).

Турист, выехавший до истечения срока, указанного в визе, выданной в визовом году, не может использовать визу путем прибавления оставшегося срока к другому визовому году.